深圳大学第一附属医院黄卫人等开发CRISPReader技术

来源：iNature

原标题：Genome Biology | 调控基因转录、翻译新技术！深圳大学第一附属医院黄卫人等开发CRISPReader技术

DNA读取对活细胞至关重要，该过程包括转录和翻译。RNA聚合酶从DNA转录mRNA拷贝，然后核糖体附着并翻译mRNA以产生蛋白质。存储在DNA中的遗传密码由基因表达“解释”，这些过程可以通过启动子，5'非翻译区（UTR）和其他遗传成分来调节。这些元素通常在确定基因表达水平中起关键作用，并且它们控制所有生物的细胞行为和表型。然而，天然调节元件具有各种类型的基序，这些基序在基因中看起来是非保守的，因此导致更复杂和不可预测的网络。通过人工装置重建基因表达模式代表了有意设计和构建生命系统的重要一步。

    2019年6月3日，深圳大学第一附属医院黄卫人、Liu Yuchen团队在Genome Biology上发表题为“Multiplexedpromoterless gene expression with CRISPReader”的文章，开发了一种控制转录和翻译水平的基因表达技术，称为CRISPReader。

为了提高无启动子基因的表达水平，研究人员通过将dCas9-VP64系统与RNA激活剂组合作为CRISPReader模块来结合转录和翻译机制。RNA激活剂在其转录后结合Rluc mRNA的5'末端（20nt）并募集小的核糖体亚基，导致增强的翻译起始。用CRISPReader模块或对照转染HEK-293T细胞。与阴性对照（dCas9-VP64+ sgRNA非特异性对照+ RNA激活剂非特异性对照）相比，CRISPReader诱导荧光素酶活性增加240倍。使用CMV和SV40启动子实现了如上所述的类似结果。

为了证明RNA激活剂的特异性，在1-20位（在3'到5'方向编号为1-20）产生了携带Watson-Crick颠换错配的变体RNA激活剂，并测试了这些不同的RNA激活剂是否针对CRISPReader介导的HEK-293T细胞中的Rluc活化。结果表明RNA激活剂对任何位置的错配都非常敏感。通过增加sgRNA或RNA激活剂的靶向区域的数量来实现更高水平的Rluc表达。总之，结果显示CRISPReader以稳健的方式促进转基因的转录和翻译。

CRISPReader通过偶联转录和翻译机制来驱动无启动子的基因表达

基因由DNA代码组成，并含有启动子和其他控制元件，用于读取这些代码。群集的规则间隔短回文重复（CRISPR）技术的快速发展使得构建对原生控制元件具有低依赖性的新型代码读取系统成为可能。我们开发了CRISPReader，这是一种以稳健方式控制无启动子基因表达的技术。我们证明该工具在控制靶向转基因的转录和翻译起始方面非常有效。 CRISPReader的一个显着特征是能够在没有传统调节元件或其他辅助因子的情况下“读取”基因簇的开放阅读框。

特别地，我们使用该策略通过从表达盒中去除启动子样元件来构建一体化AAV-CRISPR-Cas9系统，以解决现有的AAV包装尺寸问题。紧凑型AAV-CRISPR-Cas9在反式激活，DNA切割和基因编辑方面也比编码两种独立Cas9元件的双AAV载体更有效，通过在体外和体内靶向报告基因和内源基因来显示.CRISPReader代表一种新颖的基因调控的方法使得能够表达最小的基因构建体并且可以用于潜在的生物医学应用。

原文链接：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1712-5