WB 总是出现非特异性条带怎么办？

来源：生物学霸

好看的 WB 总是别人的，自己的 WB 总是杂带丛生，尤其是新课题、新抗体，总在目的条带附近出现非特异性条带。

这个时候，不妨先思考几个问题：

你的样品类型是组织还是细胞？

如果是组织，提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。

如果是细胞，传代是在 15 代以内还是 15 代以上？

细胞系是否新鲜，有没有加蛋白酶/磷酸酶抑制剂和超声处理？

思考完这些问题，我们一起再从九个方面详细分析一下，哪些因素会导致你的结果出现多条非特异性条带：

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原因：细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化。

建议：使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过 15 代）进行样品制备。

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原因：与细胞系裂解物相比，原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。

建议：用新鲜提取的，经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景；

同时，用去垢剂含量较高的 RIPA buffer 裂解组织，可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。

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原因：蛋白被降解。

建议：

提取液确保含有蛋白酶抑制剂，并超声；

蛋白样品提取后分装－20 ℃ 或－80 ℃ 短期保存，避免反复冻融，有条件尽量用新鲜提取的蛋白。

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原因：蛋白本身有很多修饰。

建议：查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰，泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。

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原因：所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同。

建议：查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码 mRNA。

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原因：蛋白存在二聚体或多聚体。

建议：SDS loading buffer 中现用现加 β－巯基乙醇或 DTT。

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原因：样本存在外源转入蛋白。

建议：检查所用样本是否有过被外源进去带有标签的靶标蛋白。如有，更换细胞系样本。

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原因：上样量过多。

建议：根据靶标表达情况，梯度上样跑胶后选择合适的上样量，通常 20~50 µg 即可。

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原因：实验操作与 CST 推荐的步骤有较大出入。

建议：

CST 推荐封闭液用 5% 脱脂奶粉／TBST，室温 1 h；

一抗稀释液、稀释比参考抗体说明书，推荐 4 ℃ 过夜孵育；

二抗用 5% 脱脂奶粉／TBST 稀释，工作浓度切忌过高，室温孵育 1 h；

要用 1XTBST 缓冲液充分洗涤。

我们通过两个案例来具体分析下：

1

细胞系对结果影响非常大

实验条件：检测靶标 Phospho-Akt（Ser473）；使用抗体：CST #4060S Phospho-Akt（Ser473）（D9E）XP® Rabbit mAb；细胞系：MCF7。

问题：出现非特异性条带。Phospho-Akt（Ser473）（绿色）检测出 2 条带，一条在预测分子量 60 kd 左右，另外一条稍大，两条 bands 强度差不多。红色荧光为内参蛋白 β-Tubulin。

图 1. 引用自客户技术咨询案例

解决方案：建议客户复苏传代较少的细胞，重新刺激、裂解之后，即得到了单一的条带。

问题分析：AKT 激酶由 3 个分子量非常相近的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成：AKT1, AKT2 和 AKT3。Phospho-Akt（Ser473）正常情况下应该只有 1 条带，但在某些特定条件下，AKT 还可以发生糖基化、泛素化等修饰，从而造成蛋白大小发生改变。在这个案例的沟通中，我们发现客户之前使用的细胞系传代超过了 25 代，所以重新用较少代数的健康细胞，用了同样的抗体，最终得到了单一条带。

国内许多实验室细胞传代并不严格记录传代次数，以至于很多老师使用的细胞自己也都不知道多少代，所以这些细胞系里蛋白表达谱是否发生变化，甚至这些细胞系是否有被其他细胞或支原体污染等问题也不得而知。因此，我们呼吁老师们重视细胞系的培养，定期排查细胞污染，控制传代次数，只用健康的细胞，确保实验可靠。

2

检测到非特异性条带还可能会发 CNS

这个有意思的案例起源于生命科学联合中心、北京大学基础医学院系统生物医学研究所尹玉新教授课题组 2017 年的一篇发表在 Nature Communications 上的文章。作者先用全长的 PTEN 抗体检测到一个比 PTENα 稍小的「杂带」，同时「杂带」的表达模式与 PTENα 类似（图 2.a）。如果作者认定这个「杂带」是抗体非特异性识别，不进行下面的深入研究，那就没有这篇大文章了。

当时，作者在探究精神激励下，又用只识别 PTEN C-terminal domain 的 CST 抗体 #9559 PTEN（138 G6）Rabbit mAb（图 2.b）和识别 N 端的 PTENα 抗体（图 2.c）在不同的癌症细胞系中检测，加上后续一系列分析和质谱验证，证实最开始看到的那条「杂带」是和 PTENα 类似的 N-terminal extended PTEN isoform，后命名为 PTENb，从而使人们对 PTEN 蛋白家族及其功能的多样性有了更深刻的认识。

图 2. a~c 引用自尹玉新教授课题组 Nat. Commun. 8, 14771 文章的 Figure 1. ,d 来自网络。

注：在 b 图中可以看到，PTEN-null 的 PC3 细胞系中抗体并没有任何条带，证实其他细胞系中得到的 PTEN 条带是特异的

如果一个蛋白有多个 isoforms，或蛋白同时发生多种翻译后修饰（PTM），理论上只要 CST 抗体的抗原表位识别的区域在这些 isoform 或 PTM 的上面，并且蛋白的表达量达到可检测水平，抗体都是能够识别到的。这是 CST 抗体性能优异的证明。

对于 CST 的抗体，都是内部研发生产并且经过多重交叉验证之后才提供给客户的，CST 尽全力保证出厂的抗体都具有高灵敏度、高特异性、高度可重复性。

如果您发现使用 CST 抗体检测到「非特异性条带」，先进行以下排查：

细胞样本：有没有被污染，有没有传代过久；组织样本：存储时间和条件是否得当，有没有发生降解。

样本提取：是否新鲜提取，是否加蛋白酶/磷酸酶抑制剂，是否超声。

有没有严格按照网站上产品页面提供的实验步骤进行实验操作。

查询数据库确认：靶标蛋白是否有多种 isoforms、影响蛋白大小的蛋白翻译后修饰或容易出现多聚体等情况。