Cell：cAMP分子被“绑架”才是导致cAMP信号区域化的根本原因

来源：BioArt

细胞间信号的传递通常需要信号分子的参与。作为细胞膜上种类最为丰富的一类受体蛋白，绝大部分的G蛋白偶联受体(GPCRs)都需要借助cAMP这一第二信使以及它的主要效应蛋白PKA来将外界的信号传入细胞内部。与此同时，一个非常重要的科学问题摆在科学家面前：为什么这些数量庞大的受体蛋白可以通过相同的cAMP信号来使细胞产生不同的响应呢？

上个世纪80年代初，cAMP信号区域化（cAMP compartmentalization）概念的提出似乎解答了这一疑惑：即不同细胞区域之间的cAMP浓度是不同的，从而不同程度地活化了处于不同时空的PKA蛋白【1】。而水解cAMP的磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）被认为在cAMP信号区域化的形成过程中扮演者至关重要的角色。意外的是，后续大量的研究结果则表明cAMP在细胞内具有很强的扩散能力【2】，与之相矛盾的是，PDEs的催化活性却很低【3】，这说明cAMP在细胞内应该会快速平衡，从而不可能形成cAMP信号的区域化。那么，细胞内cAMP信号区域化究竟是否存在以及它的形成机制是什么？这一科学争论持续了数十年却一直没有得到统一的结论。

近日，来自德国赫尔姆霍兹协会分子医学中心的Martin J. Lohse教授研究团队在Cell上发表了题为Optical Mapping of cAMP Signaling at the Nanometer Scale的研究，有望结束这一长期存在的争论。通过合成一个可视化的cAMP小分子，并直接在纳米尺度观测其在细胞内的运动，他们得出了与之前的研究结果相反的结论：正常生理水平的cAMP主要被细胞内的结合蛋白所锚定而具有很弱的流动性，进而为PDEs在其周围形成低cAMP区域创造了条件，并最终导致细胞内cAMP信号区域化的形成。

首先，为了能直接观测到cAMP在细胞内的扩散过程，作者合成了一种带有荧光标签且可以穿过细胞膜的cAMP类似物---8-FDA-cAMP。在证明其与cAMP具有类似的生物学功能之后，作者在细胞内展开了实验。作者惊奇的发现：与之前报道不同的是，基础水平的cAMP在细胞内几乎丧失流动性。为了证明cAMP流动性的减弱可能是被特定的结合蛋白“挟持”所致，作者用forskolin和IBMX刺激细胞来最大程度的升高细胞内的cAMP水平，作者发现在药物刺激的条件下，8-FDA-cAMP的扩散能力显著升高了。这些结果提示：基础水平的cAMP很有可能被细胞内的结合蛋白绑定而失去流动性，而在外界刺激条件下，升高的cAMP会饱和这些结合蛋白从而使得游离的cAMP获得较强的流动性。

为了进一步证明这些结合蛋白的存在，作者比较了8-FDA-cAMP与其他不同分子量的发光物质的扩散速率，其中包括单独的荧光素蛋白（≈0.3kDa）,EGFP(≈25kDa)以及融合蛋白Epac1-campus-PDE4A1(≈120kDa)，并根据他们的扩散效率与分子量绘制出一条标准曲线。作者发现，与其他发光物质相比，只有生理水平的8-FDA-cAMP的扩散速率要显著低于预期，这提示它们一定与细胞内的大分子发生了结合从而阻碍它们的扩散。另外，通过与标准曲线进行对比，作者推测这些与之结合的蛋白分子量大约在10—50kDa的范围。有趣的是，当给细胞过量的cAMP处理之后，8-FDA-cAMP的扩散速率又与标准曲线预期的一致，这再次验证了作者之前的推论。

那么，在证明基础水平的cAMP由于被细胞内结合蛋白锚定而大大降低其流动性之后，之前的悖论也就迎刃而解。作者推测：cAMP流动性降低使得PDEs具备充分的条件去水解附近的cAMP分子并在细胞内形成不同的cAMP浓度梯度。为了直接在细胞中测量由PDEs产生的低cAMP浓度区域的分子尺度，作者构建了一把“纳米标尺”（见图1）。简而言之，通过将cAMP响应元件与PDE通过一段linker连接在一起，而中间的linker可以使这两个蛋白分隔在特定的距离。借助这把“纳米标尺”，作者测量出PDE形成低cAMP浓度区域的尺度约在10-60nm之间,取决于不同PDEs蛋白的种类。

图1 纳米标尺的示意图

最后，总结一下。尽管cAMP信号区域化的概念的提出已经有40年的历史，但一直缺乏强有力的证据支撑。而Martin J. Lohse教授研究团队的这一研究成果则为该假说提供了分子基础，同时，他们在纳米尺度上首次观测到了cAMP浓度梯度的形成以及对PKA信号激活的调控作用，从而第一次在实验层面上证明了cAMP信号区域化的存在。这一发现使得我们对于cAMP通路的复杂性和重要性有了新的认识。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.035

参考文献

1. Brunton,L.L., Hayes, J.S., and Mayer, S.E. (1979). Hormonally specific phosphorylationof cardiac troponin I and activation of glycogen phosphorylase.Nature280, 78–80.

2. Bacskai,B.J., Hochner, B., Mahaut-Smith, M., Adams, S.R., Kaang, B.K., Kandel,E.R., andTsien, R.Y. (1993). Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase Asubunits in Aplysia sensory neurons. Science 260, 222–226.

3. Bender,A.T., and Beavo, J.A. (2006). Cyclic nucleotide phosphodiesterases:molecularregulation to clinical use. Pharmacol. Rev. 58, 488–520.