人工P450过加氧酶催化小分子烷烃选择性羟化

来源：X一MOL资讯

小分子烷烃碳-氢键的选择性羟化是长期以来一直面临的重要科学挑战之一，对于实现天然气的“气液转化”利用以满足日益增长的能源与化工原料来源需求和环境保护都有重要意义。其主要瓶颈在于烷烃分子碳-氢键的高解离能（95-105 kcal/mol）：一方面打破这种强度的结合需要极大能量；另一方面醇的活化能比烷烃更低，这就导致容易产生过度氧化产物如醛和酸，甚至二氧化碳等。虽然自然界中存在可以直接选择羟化小分子烷烃的天然酶，比如甲烷单加氧酶MMO、丁烷单加氧酶BMO、以及真菌过加氧酶AaeUPO等，但无论其催化活性还是种类数量都还不能满足工业应用的需求。开发小分子烷烃碳-氢键选择性羟化的工程酶具有十分重要的理论和应用价值。中国科学院青岛生物能源与过程研究所丛志奇团队最近报道了利用一种人工P450过加氧酶来选择性羟化小分子烷烃的新方法（图1）。细胞色素P450酶是公认的多功能生物氧化催化剂，其催化惰性碳-氢键选择性氧化的能力尤其受到关注，但以小分子烷烃（<C5）作为天然底物的P450酶还未有报道。近年来，包括2018年诺贝尔奖得主Arnold教授在内的多个国际知名研究小组在这一领域取得重要进展，利用蛋白质工程（图1 Approach Ⅰ）和底物误识别策略（图1 Approach Ⅱ）等手段获得了一系列对丙烷和乙烷等小分子烷烃具有高选择性和高活性的P450工程酶。然而，与天然P450酶一样，这些工程酶催化功能的实现依然高度依赖还原辅酶NAD(P)H及其复杂的还原伴侣电子传递体系来活化分子氧，在一定程度上限制了其体外的催化应用。

图1 不同策略的P450酶催化小分子烷烃的选择性羟化。图片来源：ACS Catal.此前，丛志奇团队开发出双功能小分子（DFSM）促进的P450BM3过加氧酶催化体系，使其能够直接利用H2O2实现对非天然底物如苯乙烯和苯甲硫醚等的高效氧化（Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 7628-7633）。H2O2作为一种绿色经济的氧化剂，已被广泛用于有机合成和化工领域的氧化转化。在P450酶催化中使用H2O2替代O2，不需要辅因子及其复杂的还原伴侣电子传递体系，可以极大简化P450酶的催化路径，提高其催化应用潜力。在该策略中，双功能小分子N-(ω-1-咪唑基-脂肪酰基)-L-氨基酸衍生物一端的酰基氨基酸基团作为锚定基团与BM3相结合，另一端的咪唑基作为“酸-碱”催化基团协助血红素活性中心活化H2O2生成Compound Ⅰ，进而催化底物氧化（图2）。

图2 双功能小分子（DFSM）促进的P450过加氧酶体系。图片来源：ACS Catal.近日该团队将上述策略与酶的半理性设计有机结合，通过对活性口袋关键位点的叠加突变研究，首次成功获得了对丙烷及其他低碳烷烃（C3-C6）具有高羟化活性和选择性的工程P450过加氧酶（图3）。

图3 人工P450BM3过加氧酶系统催化小分子烷烃选择性羟化。图片来源：ACS Catal.首先，作者选择具有狭长底物口袋的长链脂肪酸羟化酶P450BM3作为改造对象，并根据前期研究和文献报道对其底物口袋进行半理性设计，选定了几个可能影响酶活的关健位点。包括影响酶与H2O2以及烷烃底物结合的F87位点、对sp3 C−H键羟化具有潜在作用的T268位点、以及对底物口袋空间具有明显调节作用的A82和A184位点（图4）。在选定目标突变位点基础上，采用通常的收缩底物口袋策略进行叠加突变，建立了一个较小的P450BM3突变体文库。

图4 叠加突变目标突变位点的选择。图片来源：ACS Catal.随后作者以丙烷羟化为目标反应进行突变体筛选。单突变体中，仅F87A有微弱活性，引入T268位点突变后，F87/T268双突变体的丙烷羟化活性得到显著提升。F87A/T268I与F87V/T268I的异丙醇产物生成速率（PFR）分别达到635和499 μmol min-1 (μmol P450)-1（1 min 反应），30 min反应的催化转化数（TON）可达1582和1264（图5 A），接近天然过氧化酶AaeUPO的两倍。异丙醇产物选择性也优于已报道的P450BM3烷烃羟化体系（异丙醇/正丙醇 > 20/1）。进一步引入A82和A184位点突变显示，仅三突变体F87A/T268I/184V和F87A/T268I/184I对活性有轻微提升。需要指出的是，在不添加DFSM分子的对照实验中，所有突变体均无明显活性。上述结果表明作者利用DFSM分子协同半理性设计策略成功构建了可高选择性羟化丙烷的人工P450过加氧酶系统。作者随即进行了底物拓展研究，发现此系统对正丁烷、正戊烷和正己烷羟化同样显示优异催化性能。突变体F87A/T268I/A82T的2-丁醇产物生成速率达到1085 μmol min-1 (μmol P450)-1，远高于天然丁烷单加氧酶（BMO），也略优于已报道的还原辅酶NADPH依赖的P450cam工程酶；该系统的TON亦优于天然过加氧酶AaeUPO，最优突变体F87A/T268I/A184I的TON为2368（图5 B）。丁烷氧化的区域选择性优于丙烷，2-丁醇选择性高达96%~99%。作者同时发现87位点氨基酸残基对产物手性有重要影响，这为进一步通过对相关位点进行优化以获得高度光学活性产物提供了信息。

图5 人工过加氧酶P450系统催化的丙烷、正丁烷、正戊烷、正己烷羟化反应结果。图片来源：ACS Catal.（VI =F87V/T268I, AI = F87A/T268I, AIT = F87A/T268I/A82T, AIS =F87A/T268I/A82S, AIM = 87A/T268I/A82M, AIV = F87A/T268I/A184V, AII = F87A/T268I/A184I, AITI = F87A/T268I/A82T/A184I, AISI = F87A/T268I/A82S/A184I, AITV = F87A/T268I/A82T/A184V, AIMV = 87A/T268I/A82M/A184V.）双突变体F87/T268催化己烷氧化主要生成2-己醇，同时伴随少量3-和1-己醇，比如F87A/T268I的3-/2-/1-己醇的比例为11:87:2。另外作者发现82位点显著影响反应的区域选择性，A82M突变体主要生成3-羟化产物（图5 C, D），比如F87A/T268I/A82M的3-己醇选择性>82%。不同于丙烷和丁烷羟化，三突变和四突变的引入使催化活性提高至双突变的2-3倍。F87A/T268I/A82M/A184V呈现最优的3-己醇催化活性（TON=1095），生成2-己醇的最优突变体为F87A/T268I/A82T/A184V（TON=1107）（图5 D）。这些结果显示可通过调节底物口袋来进一步提高反应的催化活性和区域选择性。该研究首次实现了以H2O2为末端氧化剂驱动工程P450过加氧酶催化丙烷等小分子烷烃（C3-C6）的高选择性羟化，其反应TON与天然过加氧酶AaeUPO相当，产物生成速率与已知最好的NADPH依赖P450工程酶相当，为开发小分子烷烃碳-氢键选择性羟化的工程酶提供了新的途径和思路。值得一提的是，T268位点的突变对提高P450过加氧酶的烷烃羟基化活性起到至关重要的作用。而通常认为T268残基是还原辅酶NADPH依赖型P450酶中高度保守位点，对其天然催化功能的实现几乎是不可或缺的。作者推测DFSM分子在当前系统下较好的替代了T268的部分功能，转而使其可被灵活突变优化，有利于结合各种不同的疏水性烷烃小分子。这对P450过加氧酶生物催化剂的分子设计和工程化改造具有一定的借鉴意义。这一成果近日发表在ACS Catalysis上。该文章的第一作者为中国科学院大学的博士生陈杰，通讯作者为丛志奇研究员。