PBJ：CRISPR/Cas9衍生系统dCas9在植物基因组学研究中的主要应用

来源：植物科学最前沿

CRISPR/Cas9系统自问世以来一直被广泛地应用于基因组编辑技术中，将CRISPR/Cas9系统中Cas9的两个保守的内切核酸酶结构域进行突变,RuvC催化结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸（D10A）和HNH催化结构域的第840位组氨酸突变为丙氨酸（H840A），Cas9 蛋白失去内切核酸酶活性，失去活性的Cas9称之为dead Cas9（dCas9）。dCas9不能切割DNA但仍能与sgRNA形成复合物并与特定DNA序列结合。近年来，由CRISPR/Cas9衍生而来的CRISPR/dCas9系统广泛应用于基因表达调控、表观遗传调控、染色质分布和基因修饰。该系统不会造成DNA双链断裂，可避免在特定基因上的永久突变对宿主的影响。

CRISPR/dCas9系统的作用机制是：人工设计合成的一小段特异性RNA序列（single guide RNA，sgRNA）与dCas9和转录调控因子形成的融合蛋白组成 复合体；该复合体中的sgRNA的碱基互补配对序列与目标基因结合，dCas9-sgRNA复合物作为一个支架将一系列效应分子募集到特定的位置来激活基因转录或因空间位阻阻止RNA聚合酶与启动子结合及抑制转录延伸，从而发挥调节功能。

近日，马来西亚博特拉大学Mahdi Moradpours实验室在国际知名期刊Plant Biotechnology Journal 上发表了题为“CRISPR/dCas9 Platforms in Plants: Strategies and Applications beyond Genome Editing”的综述。论述了CRISPR/dCas9介导的植物基因调控的最新进展。讨论了利用CRISPR/ dCas9系统进行作物改良的相关策略，以及CRISPR/dCas9系统在作物功能基因组学中的应用前景。

作者从6个方面对CRISPR/dCas9这一系统进行了阐述。1、dCas9在调控基因表达中的作用；2、基于dCas9的系统在单碱基编辑中的应用；3、dCas9在表观基因组编辑中的应用；4、dCas9在染色质分布中的应用；5、dCas9在植物活细胞染色质成像中的应用；6、dCas9降低脱靶率的作用。其中着重详细地论述了dCas9在调控基因表达中的作用。

在这一部分中作者详细介绍了CRISPR/dCas9系统中三个主要组成部分：dCas9，sgRNA和转录因子。对于基因表达的调控该系统即可用于激活特定基因的表达(CRISPR activation,CRISPRa) 也可用于抑制特定基因转录（CRISPR interference ,CRISPRi）。此外还讲述了目前应用CRISPR/dCas9系统促进植物转录激活的三种不同策略：dCas9与不同转录激活子融合（主要有dCas9-VP64，dCas9-EDLL，dCas9-VP64-EDLL）；修饰的gRNA sacffolds招募转录激活子（主要有dCas9-VP64-MS2-VP64，dCas9-VP64-MS2-EDLL，SAM-modified sgRNA）以及多基因同步激活调控植物基因表达的多重转录激活系统。

最后作者进行了总结和展望，强调CRISPR/dCas9激活系统对研究转录调控因子具有重要意义。这一系统不仅可以通过酶的多种激活作用应用于代谢工程，从而对解析代谢途径以及如何增加有价值代谢产物的产生提供重要的见解。也可用于控制重要性状（如抗非生物胁迫和生物胁迫）的关键作物基因的上调。此外，基于dCas9的DNA/染色质修饰酶可用于实现对植物表观基因组更好的控制。基于dCas9的染色质结构和DNA环的修饰显示了CRISPR技术作为未来研究植物目标染色质结构重塑一种强有力的工具。

文章链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/pbi.13232