无电极仿生纳米孔芯片实现1美元高通量单分子分析

来源：X一MOL资讯

原标题：陈洪渊、黄硕团队Sci. Adv.：无电极仿生纳米孔芯片实现1美元高通量单分子分析

新兴的纳米孔技术是一种基于膜片钳的单通道电流分析技术，广泛用于蛋白质分析、金属离子检测、有机小分子识别、纳米粒子表征、单分子化学、单分子质谱以及DNA测序 [1]。然而，自1993年首个纳米孔传感概念的展示以来[2,3]，无论纳米孔技术的仪器形式如何变化，其检测机理完全是来源于依赖膜片钳技术的电信号检测方法。虽然这种方法具有超高的时间分辨率（~10 μs）和电流分辨率（<0.1 pA），但受限于现有的微电子和微电极加工技术的技术门槛和成本限制，扩大检测通量是该领域的主要瓶颈。现阶段，单分子基因测序是纳米孔传感领域内最重要的应用，同时也伴随着海量的数据采集需求，随着纳米孔测序技术产业化逐步展开，人们对超高通量纳米孔测序（大于100万个孔道）的需求愈发迫切，因此亟待发展一种新型的纳米孔检测模式，以不显著提高检测成本为前提突破现有检测通量的局限。

《道德经》有云：“人法地、地法天、天法道、道法自然”。大自然45亿年的生物进化过程早以筛选出一系列结构最为精简，运转最为高效的跨膜输运机制，对诸多生物学过程进行精准调控。多巴胺、血清素、乙酰胆碱、氨基酸递质等重要的神经递质可经由突触前膜释放后与相应突触后膜上的受体结合，实现信号在神经元间的传递，完成大脑的复杂活动(图1，A) [4]。T4噬菌体能专一地吸附在寄主细胞表面的相应受体上，将头部的DNA通过中空的尾部（直径为2.5～3.5 nm）注入宿主细胞内进行自我复制与繁殖(图1，B) [5]。金黄色葡萄球菌分泌的α溶素 (α-HL) 能够插到宿主细胞的细胞膜上，导致细胞营养物质流失而溶解，引发诸多感染性疾病 [6]。与通过电极对并使用膜片钳仪器驱动的纳米孔技术不同，自然界内精准的跨膜运输过程往往自发产生，且完全不需要冗余的电极和膜片钳等外围电子器件的辅助，是最简化的物质跨膜输运分子机器。

图1. 启发于自然界物质跨膜运输的无电极纳米孔技术。A. 神经递质运输示意图。中枢神经递质通过与膜上的相应的神经递质受体相结合，激活膜上的离子通道,实现信息传递和调节生理功能的作用（图片来源自维基百科）。B. T4噬菌体侵染大肠杆菌示意图（图片来源自维基百科）。C. 无电极纳米孔技术原理与纳米孔荧光成像。基底中的钙离子自由扩散穿过纳米孔与液滴中的钙离子荧光染料结合，产生荧光信号，间接实现纳米孔的荧光成像（图片来源自论文作者）。

受此启发，南京大学化学化工学院生命分析化学国家重点实验室陈洪渊、黄硕团队开发了一种新型的纳米孔检测方法，并将其命名为无电极纳米孔技术（DOP，DiffusiOptoPhysiology），也是世界首个无需电极的单分子纳米孔检测方法（图1，C）。该团队在纳米孔的两侧分别加入钙离子与钙离子荧光染料，在浓度梯度驱动下，钙离子自由扩散穿过纳米孔与荧光染料结合释放荧光信号，从而间接实现纳米孔在液滴-凝胶界面双分子层上实时成像，并成功展示了其对小分子、高分子与生物大分子的单分子传感。

无电极大孔径ClyA纳米孔检测dsDNA。图片来源自论文作者

这项技术充分简化了传统的纳米孔检测模型（公式1），去掉了电迁移项在物质传递中的贡献，仅由扩散、化学反应和流体三项来决定物质的传递（公式2）：

公式1（电生理纳米孔模型）： 

公式2（DOP模型）：

通过进一步对电解质溶液与孔道优化，其传感性能可与传统的电生理纳米孔技术相当，而理论检测密度可高达104 pores/mm2。由于DOP无需预留电极空间，其测量体积可进一步减小到~30 pL，检测体积上是现有纳米孔技术的百万分之一，显著降低了样品消耗，非常适用于丰度极低的分析物测量。此外，不使用电极让研究者可以很轻松的构建微液滴DOP检测阵列。这种检测模式非常适用于多组分，平行化的高通量药物筛选，其理论检测密度可达103bilayers/ mm2。在此基础上，该团队构建了高通量可抛弃式单分子分析芯片，该芯片仅需简单且无生物毒性的材料构成，现有芯片成本不足1美元，非常适用于临床检测中的可抛弃式检测需求，并有望进入日常生活（图2）。

图2. 指尖型无电极纳米孔检测芯片。图片来源自论文作者

该工作相关论文发表于Science Advances，由南京大学化学化工学院陈洪渊院士与黄硕教授为共同通讯作者，南京大学化学化工学院直博生王玉琴为第一作者。

参考文献：

1.S. Huang, Nanopore-based sensing devices and applications to genome sequencing: a brief history and the missing pieces. Chin. Sci. Bull. 59, 4918-4928 (2014).

2.S. M. Bezrukov, J. J. Kasianowicz, Current Noise Reveals Protonation Kinetics and Number of Ionizable Sites in an Open Protein Ion Channel. Phys. Rev. Lett. 70, 2352-2355 (1993).

3.S. L. Keller, S. M. Bezrukov, S. M. Gruner, M. W. Tate, I. Vodyanoy, V. A. Parsegian, Probability of Alamethicin Conductance States Varies with Nonlamellar Tendency of Bilayer Phospholipids. Biophys. J. 65, 23-27 (1993).

4.S. G. Amara, M. J. Kuhar, Neurotransmitter Transporters - Recent Progress. Annu Rev Neurosci 16, 73-93 (1993).

5.H. Furukawa, T. Kuroiwa, S. Mizushima, DNA Injection during Bacteriophage-T4 Infection of Escherichia-Coli. J Bacteriol 154, 938-945 (1983).

6.M. J. Anderson, Y.-C. Lin, A. N. Gillman, P. J. Parks, P. M. Schlievert, M. L. Peterson, Alpha-toxin promotes Staphylococcus aureus mucosal biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol 2, 64 (2012).