绘制单细胞分辨率人类和小鼠的肠神经系统图谱学术资讯

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肠道神经系统（enteric nervous system, ENS）负责协调肠道内的各种功能，包括运动、消化以及屏障防御【1】。ENS由于年龄、性别、昼夜节律和疾病等方面的不同而具有异质性，很多肠道和肠道外的疾病也与ENS功能障碍相关，如直接影响肠神经元的单基因神经疾病和伴有早期肠道运动障碍的神经疾病紊乱等【2】。但由于其细胞的稀有性和多样性，一直没能识别全面的分子表征。
2020年9月3日，Broad 研究所Aviv Regev、Ramnik J. Xavier和Orit Rozenblatt-Rosen在Cell上发表了题为“The Human and Mouse Enteric Nervous System at Single-Cell Resolution”的文章，克服了上述困难，建立了一个跨越物种，年龄，性别，区域和昼夜节律的单细胞分辨率ENS图谱。

神经元只占肠细胞的不到1%，研究人员首先使用多种不同基因型的小鼠模型来富集成熟的肠道神经元，流式细胞术标记后采用单细胞核转录组测序，但常用的两种测序策略在结肠ENS核测序中效果有限，而在脑中则效果很好。所以研究人员通过优化缓冲液等手段改进了ENS核提取方法，开发了新的单细胞核转录组测序手段，并经电子显微镜检测，能够获得完整的细胞核。新方法命名为RAISIN RNA-seq。接下来研究者将使用RAISIN RNA-seq方法来解析小鼠和人的ENS，该方法效率更高，污染更少。

图1. RAISIN RNA-Seq方法建立了小鼠和人的ENS图谱
利用RAISIN RNA-seq方法，研究人员从29个不同年龄、性别以及昼夜节律的成年小鼠的ENS中获得了5696个高质量的转录体，包括2657个神经元和3039个神经胶质，分属21个神经元亚群和3个神经胶质亚群。
通过基因表达差异分析，21个神经元亚群主要分为五组：1）Chat+Tac1+的兴奋性运动神经元和2）Nos1+的抑制性运动神经元，协调肌肉的收缩和松弛；3）CGRP+的感知神经元，感知肠道内的物理和化学刺激；4）Penk+的中间神经元，传递神经元之间的信号；5）Glp2r+的促分泌/血管舒张神经元，驱使分泌物和液体向其他细胞类型移动。每个组的神经元亚群也都有自己的独特特征。而神经胶质多样性相对较低，主要依据差异基因和转运体分为3个亚群。如Glia1亚群高表达Gfra2；Glia2亚群高表达Slc18a2；Glia3亚群高表达Ntsr1。研究人员接着分析了更细致的特征，如感知神经元表达组织稳态和免疫的关键转录因子、ENS组成多样性和表达谱与小肠定位、昼夜节律以及年龄有关。

图2. 小鼠ENS主要分为21神经元亚群和3个神经胶质亚群
随后，研究人员开发了MIRACL-seq方法，该方法通过过载单细胞液滴和识别特异性表征，能够从复杂的组织中描绘更稀有的细胞类型。应用该方法分析了79293个高质量的细胞核，根据基因表达差异主要包含473个神经元（12个亚群）和429个神经胶质（2个亚群）以及包括卡哈尔间质细胞在內的43个小肠稀有细胞。

图3. MIRACL-seq 方法描绘小鼠ENS转录图谱
进一步，通过MIRACL-seq方法，研究人员也在16位结直肠癌患者中，建立了人类场神经元的转录图谱。共筛选了146442个高质量的细胞核，包括多种细胞类型，其中有1445个神经元分属14个亚群。经过分析后发现，人类的ENS亚群与小鼠共享核心转录特征。除此之外，肠神经元表达基因与结肠中的多种细胞类型相互作用，一些风险基因也与肠疾病以及肠外疾病相关。

图4. 基于RAISIN RNA-seq和MIRACL-seq 方法描绘和分析小鼠和人类的ENS转录图谱
总的来说，研究人员开发了RAISIN RNA-seq和MIRACL-seq方法，分别用来分析完整的细胞核和未标记的稀有细胞类型。其中，5068个肠神经元来自小鼠中的1187535个细胞核，揭示了神经元的多样性以及基因差异表达与昼夜节律、疾病之间的关系；1445个肠神经元来自人类的436202个细胞核，揭示了保守和特异性的转录特征，并阐述了其与神经上皮、神经机制和神经免疫之间的相互作用。此外，人类ENS也表达神经病理、炎症和肠外疾病的风险基因，表明神经元对疾病也具有潜在的影响。

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