基因组编辑技术在禾本科植物中的发展和应用

来源：植物科学最前沿

基因组编辑技术主要是利用位点特异人工核酸酶在基因组靶位点处引入DNA双链断裂（DSB），再经细胞自身的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）对DSB进行修复，最终实现目标基因敲除和碱基编辑等基因组遗传修饰。由于其在突变体创制和作物种质创新中表现出强大的优势，因此近几年来该技术在禾谷类作物研究中得到了快速发展和广泛应用。

近日，美国密苏里大学哥伦比亚分校植物科学系和唐纳德•丹福斯植物科学中心Bing Yang（杨兵）教授在期刊aBIOTECH在线发表综述文章“Genome editing in grass plants”（点击题目看原文）。文章概述了基因组编辑技术在禾本科植物中的发展和应用。同时，作者总结展望了该技术在保障和改良禾谷类粮食作物产量品质中的应用前景。

在近30年来发展历程中，逐步形成了以锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活效应蛋白核酸酶(TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)等三类人工核酸酶为主的基因组编辑技术。ZFNs和TALENs在组成上类似，由DNA结合结构域与FokⅠ核酸酶结构域融合形成，且FokⅠ需形成二聚体才能发挥内切酶活性。CRISPR/Cas系统则利用RNA引导序列与靶位点DNA序列以Watson-Crick碱基配对而定位，且Cas蛋白单体行使核酸酶功能。相对于Cas蛋白的PAM序列依赖性，ZFNs和TALENs则在靶位点选择时具有一定的优势；但由于CRISPR/Cas系统在载体构建和多位点编辑的优势，使其在禾谷类作物基因组编辑中发展更快应用更广泛。目前通过选用不同的Cas蛋白(例如Cas9或Cas12a)和Cas蛋白人工进化(例如xCas9或Cas9-NG)等方式，可有效地提高编辑特异性和扩宽识别PAM。此外由于Cas12a的温度敏感性，也可通过改变温度调控Cas12a在禾谷类作物中的编辑活性。

CRISPR/Cas系统的衍生技术也在禾谷类作物中不断得到发展与应用。这其中最重要的就是单碱基编辑技术，该技术主要通过核苷酸脱氨酶与Cas9切口酶(Cas9(D10A))形成的融合蛋白在sgRNA的引导下结合在基因组靶位点处，将靶碱基脱氨形成新的嘧啶或嘌呤，最终实现靶碱基的定向替换。目前，基于各种胞嘧啶脱氨酶和大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶的各种胞嘧啶碱基编辑技术和腺嘌呤碱基编辑技术已成功地应用于水稻、小麦和玉米中，实现了碱基对G·C与A·T的互换。此外，通过将转录激活蛋白(VP64和TAD等)或转录抑制蛋白(SRDX)融合在dCas9上，从而实现水稻内源靶基因的转录激活或抑制。

此外，基于CRISPR/Cas系统而来的高通量基因组编辑技术和低成本突变检测方法可实现水稻的全基因组层面的突变体库创制和突变体库快速筛选和鉴定，这将对水稻功能基因组学研究提供强有力的工具。将Cas蛋白和sgRNA mRNA复合物直接通过基因枪轰击等方法导入水稻和小麦细胞可获得Transgene-Free的基因编辑材料。这些非转基因方法有助于基因编辑材料避开转基因作物安全监管。目前已有玉米和水稻的基因编辑品种获批免除转基因作物安全监管。因此，进一步开发新基因组编辑技术和扩展其应用范围对促进禾谷类作物功能基因组解析以及加快禾谷类作物种质创新进程具有重要意义。

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Char, S.N. & Yang, B. aBIOTECH (2019). https://doi.org/10.1007/s42994-019-00005-x

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