欧洲疫情卷土重来，新冠病毒糖基化研究不可忽视

来源：生物学霸

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的大流行已迅速成为全球的社会经济危机。截止目前，SAR-CoV-2 病毒在全球已感染了超 3,000 万人，并导致近 100 万人死亡。

病毒表面的刺突蛋白（S 蛋白）与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶 2（ACE-2）结合，以启动感染。S 蛋白由两个功能亚基（S1 和 S2）组成。S1 包含受体结合结构域（RBD），让病毒初步附着到宿主细胞表面，而 S2 负责膜的融合，使得病毒进入宿主细胞。

S 蛋白不可忽视的糖基化修饰

每个 S 蛋白有 22 个 N-连接糖基化位点和至少 2 个 O-连接糖基化位点，被来源于宿主的多糖广泛糖基化[1-3]。当后代病毒颗粒形成时，病毒通过挟持宿主细胞内质网-高尔基体中间室的糖基化机制来实现糖基化。因此，S 蛋白虽然有其独特的糖基化位点，但也带有宿主细胞的糖基化模式特征。

SARS-CoV-2 S 糖蛋白结构示意图，含 22 个 N-糖基化位点[2]。

S 蛋白的糖基化有助于增加蛋白的稳定性和溶解度。更重要的是，糖基化可以掩饰蛋白的免疫原性表位，从而使病毒逃避宿主免疫反应的能力得以增强。S 蛋白不仅是疫苗开发的主要靶点，也是血清学检测的重要成分。

为了促进 SARS-CoV-2 诊断和治疗的研究，R&D Systems® 的研究团队已在几种常用的宿主细胞系（HEK293 细胞、CHO 细胞和 Sf21 细胞）中表达 S 蛋白的 RBD。不同的宿主细胞具有独特的糖基化能力，因此它们表达的 RBD 蛋白有望表现出不同的糖基化特征。我们利用之前开发的聚糖直接荧光标记（DFGL）工具来分析糖基化[3]，为不同目的下选择最相关的 RBD 重组蛋白提供了快速指引。

不同表达体系，RBD 糖基化特征大不同

1.O-连接糖基化

为了研究刺突 RBD 蛋白的各种聚糖结构，我们首先利用 O-聚糖特异性的唾液酸转移酶 ST3 Gal1，通过 ST3 Gal1 加入 Cy5 荧光标记的唾液酸，使得 O-聚糖可通过荧光成像仪轻松检测。

分别检测经过产气荚膜梭菌神经氨酸酶（Neu）或内切糖苷酶（EF）预处理及未经过预处理的 O-聚糖：神经氨酸酶去除糖蛋白上现有的末端唾液酸残基，并打开 O-聚糖上的位点，以便 ST3 Gal1 加入 Cy5 标记的唾液酸（Fig 1C 下）。内切糖苷酶 EF 是一种 O-糖苷酶，能够有效去除 O-聚糖简单的 Core-1 结构，但复杂的 Core-2 和 Core-3 结构不受影响（图 1C 上）。

Fig 1. 利用 CMP-Cy5-唾液酸和 ST3 Gal1 检测 CHO、HEK293、Sf21 和 Tn5 细胞所表达的 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白上的 O-聚糖。通过 SDS-PAGE 分离样本，并利用 TCE 染色成像（A）和荧光成像（B）。图中显示了描述酶促反应和荧光标记的模型（C）。

首先，我们利用 ST3 Gal1 标记未唾液酸化的 O-聚糖，并检测所有四种 RBD 蛋白的荧光（Fig 1，一泳道）。神经氨酸酶的预处理显著增加了来源于 HEK293 的刺突 RBD 蛋白的标记，而来源于 CHO 和昆虫的刺突 RBD 蛋白却没有观察到变化或变化很小（Fig 1，Neu 泳道）。对来源于 HEK293 的刺突 RBD 进行光密度分析，表明荧光强度增加了 71%，这说明来源于 HEK293 细胞的蛋白中 71% 的 O-聚糖被唾液酸化。

此外，神经氨酸酶和内切糖苷酶 EF 预处理显示四种刺突 RBD 蛋白的 O-聚糖模式存在差异。主要差异在于 HEK293 刺突 RBD 上的 O-聚糖耐受 EF 处理，表明 HEK293 所表达蛋白包含其它类型的 O-聚糖（Fig 1，HEK293，EF 泳道）。CHO、Sf21 和 Tn5 所表达蛋白上的标记被 EF 完全去除（黄色箭头所示），表明这些细胞表达的 RBD 蛋白仅含有简单的 Core-1 O-聚糖。

2.N-连接糖基化

随后，我们使用 N-聚糖特异性的唾液酸转移酶 ST6 Gal1 检测了这些蛋白上的复合型 N-聚糖，同时使用 FUT8 检测了带有 GDP-AF555-岩藻糖的高甘露糖型 N-聚糖（Fig 2B）。我们将 MGAT1 加入标记反应中，以便将高甘露糖型 N-聚糖 Man5 转化成 FUT8 的底物。

结果表明，哺乳动物细胞 CHO 和 HEK293 所表达的蛋白大部分被 Cy5-唾液酸标记，表明它们主要含有复合型 N-聚糖（红色）。昆虫细胞 Sf21 和 Tn5 所表达的蛋白仅被 AF555-岩藻糖标记，表明它们仅含有高甘露糖型 N-聚糖（绿色）。

所有样本均对肽 N-糖苷酶 F（PF）处理敏感，证实了标记是 N-聚糖特异性的。有意思的是，通过光密度分析，我们发现只有 HEK293 表达的刺突 RBD 蛋白上的 N-聚糖被显著唾液酸化（33.5%），这与 O-聚糖的观察结果一致（Fig 2A）。

Fig 2. 利用 CMP-Cy5-唾液酸/ST6 Gal1（红色）和 GDP-AF555-岩藻糖/FUT8（绿色）分别检测 CHO、HEK293、Sf21 和 Tn5 所表达的 SARS-CoV-2 S1 RBD 上的复合型和高甘露糖型 N-聚糖。在采用产气荚膜梭菌神经氨酸酶（Neu）或肽 N-糖苷酶 F（PF）预处理之前或之后，对各种刺突 RBD 蛋白进行直接标记。通过 SDS-PAGE 分离样本，并利用 TCE 染色成像（A）和荧光成像（B）。图中显示了描述酶促反应和荧光标记的模型（C）。

通过 DFGL 检测，我们显示了四种不同细胞系所表达的 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白在糖基化上的主要差异。这些 RBD 蛋白表达的 N-聚糖和 O-聚糖类型存在明显差异（Fig 3）：

01

所有蛋白都含有 O-聚糖，但只有 HEK293 细胞表达的蛋白含有 Core-1 以外的 O-聚糖，只有 HEK293 表达的蛋白存在显著水平的唾液酸化；

02

复合型 N-聚糖仅出现在 CHO 和 HEK293 表达的蛋白中。Sf21 和 Tn5 细胞表达的蛋白存在显著水平的高甘露糖型 N-聚糖，而 HEK293 和 CHO 细胞表达蛋白仅存在较低水平的高甘露糖型 N-聚糖。

Fig 3. 四种不同宿主细胞所表达的 RBD 蛋白上的聚糖概况。CHO 表达的刺突 RBD 蛋白含有复合型 N-聚糖和 Core-1 O-聚糖。HEK293 表达的刺突 RBD 蛋白含有复合型 N-聚糖和 Core-2 O-聚糖，两者均包含末端唾液酸。Sf21 和 Tn5 表达的刺突 RBD 蛋白含有高甘露糖型 N-聚糖和简单的 Core-1 O-聚糖。

SARS-CoV-2 刺突蛋白 RBD 的糖基化研究相关工具：

参考文献：

1. Shajahan A, et al. 2020. Deducing the N- and O- glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2. Glycobiology.

2. Watanabe Y, et al. 2020. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike. Science.

3. Wu ZL, et al. 2019. Direct flu- orescent glycan labeling with recombinant sialyltransferases. Glycobiology, 29: 750-754.