继Cell之后 | 王艳丽团队再取新进展，首次揭示脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9结构

来源：iNature

由于HNH核酸酶结构域的位置远离切割位点，高分辨率的Cas9结构尚未显示出催化构象。 Nme1Cas9和Nme2Cas9是用于体内基因组编辑的紧凑型核酸酶。Nme1Cas9和Nme2Cas9都能切割很少或没有脱靶的哺乳动物基因组。但是，尚未报告Nme1Cas9和Nme2Cas9的完整结构。

2019年10月24日，中国科学院生物物理所王艳丽及马萨诸塞州大学医学院Erik J. Sontheimer共同通讯在Molecular Cell 在线发表题为“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR-Inhibited States”的研究论文，该研究报道了脑膜炎奈瑟氏球菌的两个Cas9同源物（Nme1Cas9和Nme2Cas9，II-C型）与sgRNA，dsDNA或抗CRISPR蛋白复合物的结构。 在Nme1Cas9的HNH催化状态下，可以看到活性位点保持在目标链的可裂解磷酸二酯键处，提供了活性构象的高分辨率视图。 HNH活性构象激活RuvC域。该研究结构解释了Nme1Cas9和Nme2Cas9如何读取不同的PAM序列以及AcrIIC3如何抑制Nme1Cas9活性。这些结构提供了对Cas9结构域重排，引导靶标参与，切割机制和抗CRISPR抑制的见解，从而有利于优化这些基因组编辑平台。

另外，2018年11月30日，中科院生物物理所王艳丽及章新政共同通讯在Cell 在线发表题为“Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference ”的研究论文，该论文报告了与crRNA复合的Csm结构以及同源或非同源靶RNA结合的Csm复合物的结构。总之，结构研究为crRNA介导的序列特异性RNA切割，RNA靶标依赖性非特异性DNA切割和cOA生成所需的机制过程提供了重要的见解（点击阅读）。

Cas9是II型CRISPR-Cas系统蛋白，是一种RNA可编程的DNA核酸内切酶，可通过RuvC和HNH结构域切割靶双链DNA（dsDNA）。 CRISPR-Cas9保护细菌免受入侵核酸的侵害，并提供了革命性的RNA指导的基因组编辑平台。 Cas9的活性需要CRISPR RNA（crRNA），反式激活的crRNA（tracrRNA）和DNA靶位点中的原间隔子相邻基序（PAM）序列的指导。可以将crRNA和tracrRNA融合到单向导RNA（sgRNA）中。

Nme1-Cas9-sgRNA和Nme1-Cas9-sgRNA-dsDNA复合物的整体结构

已经报道了具有不同结合形式的多个Cas9结构。然而，在可用的DNA结合的，预先切割的Cas9结构中，HNH活性位点与crRNA互补靶链（TS）的易分裂磷酸二酯相距较远，这表明HNH结构域在确定的结构之前经历了显著的构象变化切割TS。要了解TS裂解的机制，包括通过酶检测足以进行核酸酶激活的Guide-TS互补性，阐明处于DNA结合状态的Cas9复合物的催化能力至关重要。

完全互补的Nme1Cas9 sgRNA dsDNA复合物在催化状态下的结构

来自脑膜炎奈瑟氏球菌的两个Cas9同源物（Nme1Cas9和Nme2Cas9，II-C型）已被开发为基因组编辑工具。它们有1,082个氨基酸，都比常用的II-A型直系同源SpyCas9小（1,368个氨基酸），使得Nme1Cas9或Nme2Cas9以及sgRNA可以与单个腺相关病毒（AAV）载体一起被递送。 Nme1Cas9和Nme2Cas9的PAM相互作用（PI）域高度差异（52％相同），即使蛋白质的其他部分> 98％相同。这种差异导致了不同的PAM特异性：Nme1Cas9的N4GAYW / N4GYTT / N4GTCT和Nme2Cas9的N4CC（PAM序列在非目标链[NTS]上为5'至3'）。

两者也都可以被由流动遗传元件编码的抗CRISPR（Acr）蛋白抑制，这代表了控制Cas9的潜在强大的非开关策略。已经鉴定出五种抑制Nme1Cas9的抗CRISPR（AcrIIC1-AcrIIC5），除AcrIIC5Smu以外的所有抗体也均抑制Nme2Cas9。 Nme1Cas9和Nme2Cas9都能切割很少或没有脱靶的哺乳动物基因组。但是，尚未报告Nme1Cas9和Nme2Cas9的完整结构。

在这里，研究人员报告了Nme1Cas9和Nme2Cas9在5个不同功能构象中的结构：（1）Nme1Cas9-sgRNA，（2）Nme1Cas9与匹配的8 bp DNA结合，（3）Nme2Cas9-sgRNA在完全互补的DNA-结合但处于催化前状态，（4）Nme1Cas9-sgRNA处于完全互补的DNA结合和催化活化状态，（5）Nme1Cas9-sgRNA在TS切割后与完全互补的DNA结合。

文章总结

此外，研究介绍了与Nme1Cas9-sgRNA结合的有效的nti-CRISPR结构（AcrIIC3Nme），处于DNA未结合和DNA结合状态。Nme1Cas9-sgRNA-dsDNA结构代表处于催化平衡状态的Cas9直系同源物的第一个高分辨率图，其中大量读出了TS-TS异源双链骨架和位于TS可分裂磷酸埃内的HNH结构域活性位点。这些研究将提供大量新的结构和机制见解，以应用于Cas9蛋白家族。

参考信息：

https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(19)30730-0