Nature：肠类器官发育中如何调控再生能力？

来源：BioArt

肠道类器官，因其培养体系稳定、发育过程相对明确而被科学研究和药物研发广泛使用，但是，仍有很多问题尚不清楚。比如，鼠肠类器官可以在完全分化状态下持续传代，而人肠类器官只能持续培养对称完整的，一旦分化就无法传代，这是否因为培养条件没有达到最优状态？

即使研究相对清楚的信号通路，如Wnt，不同化合物抑制这个通路，却产生了不同的表型，原因在哪里？使用纯化的蛋白培养类器官的活力就不如条件培养基培养的类器官好，是因为什么呢？人胚胎类器官在培养过程中，会出现多种表型（对称型、出芽型、混合型等等），在表型不均一的情况下，科学研究想要做到高重复性会比较困难，那么这种不均一性是什么原因所导致的？在类器官发育过程中，想要在第n天获得特定的表型，比如更多的Paneth 细胞，那么如何传代才能相对准确的保证实验的可重复性？

本篇文章的研究，不但提供了全面研究类器官生长发育的方法和平台，更重要的是，将肠类器官表型和相关功能进行分类定义，为后续研究提供一定规则参考和思路，也为以上问题的解答奠定了的基础。

肠道上皮(intestinal epithelium)由一层极化的细胞组成，这些细胞具有独特的可塑性，在正常情况下能够进行分裂、增殖和分化，而在受损伤的状态下，又能够去分化，转变为大量增殖细胞以进行修复/再生(regeneration)【1,2】。在组织结构和微环境稳态的重建过程中有着数不尽的信号通路参与其中，而这个过程是如何被调控的还尚不清楚。近年来，肠道类器官因其与肠道上皮组织高度一致性而被广泛应用于科学研究和工业领域。一个完整的类器官能够从一个单个细胞长成一个高度自我调控的完整结构（详见BioArt报道：Nature 长文| 肠道类器官发育中如何打破对称性？）：单个细胞首先长成一个具有对称性的囊肿形态，随着Paneth细胞和其他吸收细胞的出现，这种对称被打破，进而长成一个出芽型类器官。类器官的这个生长过程很好的概括和模拟了上皮再生和稳态建立的形成【3】。

为了更好的研究组织修复过程，近日，来自瑞士Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (FMI)的Prisca Liberali团队在Nature 上发表了文章Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration，通过使用类器官模型，开发了一种基于影像分析的筛选平台，全面的展示了类器官生长过程中的表型变化及其相关功能信号通路，并提供了能够提高损伤后再生能力的潜在靶点。

研究人员首先建立了一个基于影像分析的筛选平台以全面的了解不同信号通路对于类器官表型变化的影响（图1），筛选的化合物总共有2789个，涵盖了目前常用的激酶抑制剂 (inhibitors of kinases)、细胞核激素受体 (nuclear hormone receptors)、转录调控因子（transcriptional regulators）等等。化合物从第0天单个细胞开始处理，共孵育4天，4天后对类器官特定细胞enterocytes (抗aldolase B)和Paneth cells (抗lysozyme)进行染色，然后对每一个类器官进行拍照，根据每个类器官内Lysozyme、aldolase B的表达强度和类器官形态进一步进行归类。 

图1  筛选流程

根据表型相似性原则【4】，共总结7种表型大类（15个表型小类）（图2左）。多次重复实验后， 确认了301种化合物及其对应的207个基因具有高度表型一致性和重复性。进一步通过等级相互作用得分（hierarchical  interaction score, HIS）对这207个基因相互作用和功能进行分析，构建出约6800 HIS 交互作用的网络，涵盖了包括Wnt信号通路的6个高度相互联系的网络 （图2右）。接下来，研究人员从每个特性表型中选出一个目标基因进行体外和体内的验证，包括Psen1 (Paneth cell hyperplasia), Casr (Wnt hyperactivation), Akt1 (enterocyst phenotype) 和Rxra (regenerative phenotype)。文章正文主要阐述了再生表型相关基因Rxra的验证过程。

图2 代表性表型（左）和HIS互作网络（右）

RXR （Retinoid X receptor）相关的信号通路参与调控肠上皮细胞（Enterocyte cell，EC）的分化，研究人员通过使用RXR的激活剂和抑制剂处理类器官，在不同时间点对类器官进行染色和利用10x Genomics单细胞基因表达解决方案进行单细胞测序分析，从正反两方面证明了RXR信号通路能够调节再生和EC分化两者之间的平衡，抑制RXR的类器官能够重新具有再生能力，而激活RXR信号通路则使得类器官成熟的更快 。动物体内实验也进一步验证了RXR对于组织再生的促进作用，对辐照诱导产生的肠炎动物进行短时RXR抑制处理后发现，动物体重和肠上皮屏障功能都有明显的提高，组织内观察到大量Goblet 细胞的生成、腺窝底部有大量增值细胞的生成和积累以及更长的绒毛生成。

总的来说，本项研究建立了基于影像的筛选平台，能够在一次筛选过程中全面阐述类器官的表型特征和生长过程，并首次绘制肠道类器官自我组装过程中相关功能基因相互作用网络图，同时，验证了RXR信号通路在肠修复过程中的重要作用，为此信号通路的研究提供了思路，为肠道修复过程中靶点药物开发提供了有力证据。

参考文献

1. Tetteh, P. W. et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell 18, 203–213 (2016).

2. van Es, J. H. et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat. Cell Biol. 14, 1099–1104 (2012).

3. Chacón-Martínez, C. A., Koester, J. & Wickström, S. A. Signaling in the stem cell niche: regulating cell fate, function and plasticity. Development 145, dev165399 (2018).

4. Levine, J. H. et al. Data-driven phenotypic disp of AML reveals progenitor-like cells that correlate with prognosis. Cell 162, 184–197 (2015).