基因编码的二氟代酪氨酸在酶催化机理方面的应用

来源：X一MOL资讯

注：文末有本文科研思路分析

近日，Journal of the American Chemical Society 在线发表了德州大学圣安东尼奥分校Feradical（Aimin Liu，刘爱民）课题组的研究论文，通过使用遗传密码扩展的技术，该课题组发现了碳-氟（C-F）键可以被半乳糖氧化酶催化断裂。该工作由博士后李家松（中国科学技术大学博士学位）为主导完成并且成为论文第一作者。

碳-氟（C-F）键是最稳定的化学键之一。因而氟在生物医药领域有着广泛的应用，氟化物可用于牙膏和饮用水中以防止蛀牙，也被药物化学家广泛用于生产抗生素、抗抑郁药、类固醇和其他药物。同时，氟化物作为纺织品和涂料，在电子用品、交通工具、户外产品业也有着广泛的应用。然而，氟化物的污染导致了对环境不可忽视的污染，于2006年出台的斯德哥尔摩公约更是把一些氟烷类有机制剂归位严重有机污染物。所以，开发利用酶催化降解氟化物的新方法迫在眉睫。

半乳糖氧化酶（galactose oxidase, GAO, EC 1.1.3.9）是含有一个铜离子的氧化酶，在真菌中广泛存在。它在医药检测、生物合成、造纸工业上有着广泛的应用前景。有趣的是，其催化中心包含一个共价交联的Cys-Tyr辅因子，由Cys-Tyr的自由基形式和二价铜一起构成的活性中心可以把D-半乳糖或其它一些一级醇氧化为醛类。李家松博士用实验室合成的二氟代酪氨酸取代了GAO的Cys-Tyr辅因子中的酪氨酸，产生了两个非常强的碳-氟键，取代了两个弱的碳-氢（C-H）键。质谱和X-射线晶体结构测定观察到GAO仍然能够打破其碳-氟键以产生成熟的辅因子（cofactor）。这是科学家首次发现碳-氟键的裂解（断裂）可以经由铜金属酶的氧化催化来实现。

Formation of Monofluorinated Radical Cofactor in Galactose Oxidase through Copper-Mediated C–F Bond Scission

Jiasong Li, Ian Davis, Wendell P. Griffith, Aimin Liu*

J. Am. Chem. Soc., 2020, DOI: 10.1021/jacs.0c08992

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：半乳糖氧化酶本身是非常特殊而且化学上又很有趣的酶，它的活性依赖于含有自由基的Cys-Tyr的辅因子。李家松博士2018年发表在Nature Chemical Biology的文章（Nat. Chem. Biol., 2018, 14, 853–860）报道了半胱氨酸双加氧酶（一类非血红素铁蛋白酶）能够实现C-F的裂解。接下来一个化学问题就是——必须是铁金属酶还是其它的金属酶也可以？该课题组的研究兴趣因此扩展到半乳糖氧化酶上。他们好奇这个酶能否断裂C-F共价键，如果可以，新形成的辅因子是否以催化功能上必须的自由基形式存在？

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：第一个挑战是基因改造过的酶能不能表达和有催化活力。接着，如何检测基因改造过的酶是否含有自由基也是个难题。经过不断讨论和尝试，羟基尿素（hydroxyurea）作为一种小分子自由基猝灭剂完美的实现了预定目标。当在新鲜纯化的酶中加入羟基尿素时，与二价铜离子相互作用的自由基被猝灭，原本由于反磁性（antiferromagnetism）无法被检测到的二价铜信号进而被EPR（电子顺磁共振）检测到。这个实验结果最终证明了基因改造过的酶部分处于含有自由基的活性状态。另一个方面，酶的选择也很重要，由于半乳糖氧化酶大部分源自于真菌，其野生型在我们常用的大肠杆菌表达系统中并不乐观。李博士使用的是Arnold课题组（2018诺贝尔化学奖）之前报道的通过定向进化获得的高表达突变体。通过不懈努力李博士解析出该定向进化突变体酶的高分辨率的晶体结构。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：该课题组的工作为人工设计金属蛋白酶或者人工合成催化剂提供了一种新的思路，为以后的药物设计的提供了可能的警示，也有助于了解氟化物的自然降解机制。该文描述的用基因方法引入带有特定修饰的非天然氨基酸来研究蛋白中辅助因子的方法，为进一步理解蛋白质自催化扩展生物功能提供了新的生物化学案列。虽然药物化学家在药物治疗中广泛使用氟化物，这个发现以及该课题组2018年在Nature Chemical Biology描述的铁金属酶的碳-氟键的氧化裂解启示我们氟化学生物学的复杂性和仍然亟待探索的诸多未知领域，氟化物可能在人体内被以不预知的方式降解。因此含氟化物需要更全面的药物设计考量和毒理实验。这些新发现同时也将为合理设计降解氟化物的酶提供了新思路。

Feradical（Aimin Liu，刘爱民）课题组：

http://Feradical.utsa.edu