增殖培养

增殖培养（enrichment culture） ，又称富集培养，指从微生物混合群开始对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法。

培养基组分增殖的影响不同类型基本培养基对杜鹃兰原球茎增殖及生长情况有显著影响。接种于1/2MS培养基的原球茎增殖速度快,长势较好,原球茎呈绿色,增殖率达120.00%;接种于MS培养基的原球茎增殖速度及长势稍次于1/2 MS,原球茎呈淡绿色,少数出现褐化现象,增殖率达95.45%;接种于VW和KC培养基的材料部分呈白色,出现水渍状或褐化,少数死亡。杜鹃兰原球茎接种10d后,1/2MS培养基中的原球茎颜色由白色转为浅绿色,接种20d后,原球茎明显增大,30d后有少数原球茎开始增殖,颜色呈黄绿色,40d时培养基中的原球茎多数已形成丛生型原球茎,颜色转为绿色。上述结果可能是由于MS培养基成分种类丰富,无机盐浓度高;VW和KC培养基只含有大量矿质元素,缺少有机元素和微量元素,无法满足原球茎正常生长的需要;1/2MS较MS培养基无机盐浓度低。由此可知,杜鹃兰原球茎生长增殖需要适量的无机盐、种类丰富的微量元素和有机元素,故接种于1/2MS培养基中的原球茎增殖率及长势显著高于其它处理。

植物生长调节物质对增殖的影响不同种类及浓度的植物生长调节物质对杜鹃兰原球茎增殖均有不同程度的促进作用,当6-BA浓度为1.0mg·L-1时,形成的丛生型原球茎较多,增殖率达142.22%,显著高于其它处理组;6-BA浓度为0.5mg·L-1时,增殖率仅次于6-BA 1.0mg·L-1处理,但部分原球茎开始分化;不添加6-BA时原球茎也有较高增殖率,但不及6-BA 0.5、1.0mg·L-1处理;6-BA浓度升高至1.5mg·L-1以上时,增殖率急剧下降,部分原球茎颜色变黄死亡。NAA、IBA对原球茎增殖的影响效果显著,NAA浓度为0.2mg·L-1时,形成的原球茎较多,呈绿色,表面长有许多白色毛状物,增殖率显著高于其它处理组,为140.29%;随IBA浓度增加,原球茎增殖率不断变化,IBA浓度为1.0mg·L-1时,增殖率最高,达170.07%,原球茎的颜色呈绿色且生长健壮未分化,浓度高于1.0mg·L-1时,原球茎的增殖率随浓度升高而下降。1

增殖培养优化技术基本培养基优化基本培养基提供植物组织生长的矿物质、碳水化合物。林木组培增殖培养中, 基本培养基优化是最经常优化的内容。MS培养基是在被子植物门林木组织培养中最为常用的培养基。其具有较高的无机盐浓度, 常常在大多数树种中应用。但是因为树种不同MS培养基有很多地方需要调整, 笔者在快速繁殖美国红枫“秋焰” (Acer×freemanii) 、“萨摩赛特” (Acer rubrum‘Somerset’) 中增加硝酸铵、硫酸盐含量改良MS培养基, 发现改良MS对不定芽的增殖作用最明显, 增殖倍数显著高于培养基MS、WPM和1/2MS等。然而在桦树类增殖培养中, 无机盐含量较低的WPS或者1/3MS等培养基更有利于不定芽的增殖, 如果增加无机盐的含量很容易导致紫叶白桦 (Betula populifolia‘Whitespire’×B.‘Crimson Frost’) 、垂枝桦 (Betula pendula Roth) 等树种的玻璃化。我们在山新杨 (Populus davidiana×bolleana) 组培工厂中利用1/2MS作为基本培养基, 用微茎段扦插的方法提高增殖倍数3~4倍。培养基中Ca2+浓度对于其试管苗的增殖生长也起到重要作用, 其浓度增加可有效抑制玻璃化及茎尖坏死, 因此也常常需要通过增添来优化。另外增殖培养的基本培养基优化时p H值的影响也应该是优化的范围, 而且往往容易忽略, 大多数树种培养基中p H值的范围在5.8~6.2之间均可, 但很多树种需要优化, 例如曹增强等[1]通过试验发现适当的提高培养基p H值 (6.0~6.5) 会促进蓝莓分支组培苗的分支, 这样可以大幅提高增殖倍数。培养基p H为7.0时, 则会促进蓝莓组培苗对Fe、Ca和B的吸收。

不同植物激素种类及配比优化植物激素是在调控植物生长发育过程中具有十分重要且复杂的生理效应。在林木快繁增殖培养中主要应用细胞分裂素和生长素调节优化不定芽的增殖培养, 细胞分裂素过去常常用6-BA, KT、ZT等。近年来TDZ和CPPU常常用在增殖培养中, CPPU是一种具有显著生物活性的细胞分裂素, 活性远高于一般的嘌呤类细胞分裂素，它还有独特的优势在于促进细胞分裂后持续的促进生长能力。TDZ作为一种有效的形态发生调节剂, 其特点是通过单独或与其他生长调节物质共同对植物细胞起作用, 并具有相当高的活性。植物组培中常用的生长素有IBA、.2, 4-D和NAA等, 增殖培养的优化过程中不但需要添加细胞分裂素和生长素绝对含量, 而且要优化相对含量, 由于植物激素添加含量极 (上接第80页) 微, 试验设计添加常常是失之毫厘谬以千里。随着生物统计学的发展与应用, 近年来利用二次回归旋转设计等能够较好的筛选植物激素的绝对含量和相对含量。同时应该考虑连续多次增殖培养高浓度细胞分裂素的添加会导致组培苗玻璃化的危害。

最佳增殖时间和培养代数优化技术在增殖过程中, 不定芽的生长是个曲线生长过程, 生长速度从启动生长—快速生长—缓慢生长的过程, 为了实现增殖培养高效的繁殖速度, 需要培养过程中细致观察, 在最恰当的时间进行继代培养。同时不定芽的来源往往是腋芽或间接的愈伤组织等, 继代培养代数太短往往繁殖效率低, 继代培养代数过长往往伴随玻璃化危害、退化等情况的发生。

其他优化技术其他优化技术主要包括: (1) 优化接种数量, 控制接种不定芽的密度。在增殖优化过程中很多实践者发现不定芽的密度也是需要优化的技术, 这点往往被理论学者忽视, 笔者发现为了充分利用培养基、光照和培养空间, 在培养容器内“品”字形接种不定芽, 根据每次接种树种的不同和不定芽的大小调整接种数量。 (2) 优化培养基的注入量。由于不同的树种在增殖阶段生长速度有差异, 增殖时间内消耗培养基的含量自然就会有差异, 因此为了降低成本需要通过细致入微的观察调整优化培养基的注入量, 有时候也可以考虑重复使用培养基, 笔者在山新杨增殖培养中曾试验控制培养基的含量, 取得了较好的效果。2

本词条内容贡献者为:

张磊 - 副教授 - 重庆师范大学