BioLabs Protocol：烟草萤火素酶互补实验检测蛋白互作

来源：植物生物学

实验原理

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。目前应用最为广泛的萤火素酶基因来源于北美萤火虫（fireflyluciferase）, 该基因编码550个氨基酸组成的萤火素酶蛋白(大小为62 kDa)。萤火素酶可催化底物萤火素发生氧化, 发出最强波长在560 nm左右的生物荧光(bioluminescence)。

本实验原理是以萤火素（luciferin）为底物来检测萤火素酶（luciferase）的活性。在实验中, 萤火素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段, 即NLuc（2–416aa）和CLuc (398–550 aa)，并分别连接在两个载体pCAMBIA-1300-NLuc (pNL)和pCAMBIA1300-CLuc (pCL)上。实验中, 待测的2个目标蛋白的编码序列分别连在两个载体上，将目标基因与报告基因融合, 获得含有目标基因的重组质粒。如果2个目标蛋白发生相互作用,萤火素酶的NLuc和CLuc就会在空间上足够靠近, 从而发挥萤火素酶活性,分解萤火素底物并产生荧光

实验材料

实验材料为4周苗龄的本氏烟草(Nicotiana benthamiana L.)

pCAMBIA1300-NLuc (pNL)质粒(图1A)

pCAMBIA1300-CLuc (pCL)质粒(图1B)

农杆菌感受态细胞(GV3101)

1/2MS培养基(PhytoTechnology Laboratories,CatNo.M519)

 乙酰丁香酮(Sigma, Cat No.2478-38-8)

萤火素(D-luciferin) (Biovision, Cat No.7903;100mmol·L–1母液于-80°C保存, 使用浓度为1mmol·L–1)

植物活体分子影像系统(Night SHADE LB 985,Berthold Technologies)

 1 mL注射器

蛋白提取液: 50 mmol·L–1 HEPES, pH7.5, 150mmol·L–1 KCl, 1 mmol·L–1 EDTA, 0.5% TritonX-100 (Amresco, Cat No.9002-93-1), 1mmol·L–1 DTT, 1× protease inhibitors (Roche, CatNo.30827-99-7), 现用现配。

Anti-luciferase antibody (Sigma, Cat No.L0159)

Anti-CLuc antibody (Sigma, Cat No.L2164)

Anti-HA antibody (CWBIO, Cat No.CW0092)

实验流程 

1. 融合蛋白表达载体的构建

(1). 参考植物表达载体（图1）。利用pCAMBIA-1300-NLuc (pNL)和pCAMBIA1300-CLuc (pCL)中的酶切位点,将目标基因与报告基因融合, 获得含有目标基因的重组质粒。

(2). 将构建好的重组质粒分别转化农杆菌感受态细胞GV3101)。

图1 表达载体示意图（引自赵燕等，植物学报，2020）

(A) pCAMBIA1300-NLuc (pNL); (B) pCAMBIA1300-CLuc (pCL); (C) pCAMBIA1300-HA-NLuc (pHNL); (D) pCAMBIA1300-CCLuc(pCCL)。构建的表达载体中均包含pCAMBIA1300骨架, NLuc位于目标基因C末端, CLuc位于目标基因的N末端或C末端; 序列中显示的是单酶切位点。MCS: 多克隆酶切位点; L: 连接序列; RBS: 转录终止子; ATG: 翻译起始密码子; TGA: 翻译终止密码子; HA: 标签蛋白

 2. 烟草注射

烟草转化可参考：

【植物】农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化

(1). 选取1个月左右生长健壮的植株，取伸展的烟草叶片(图2A), 将混好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证相同的生长背景, 需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上，相同的菌液至少注射3–5枚烟草叶片，以保证后续的实验观察。

(2). 2-3天观察取样。为保证蛋白在烟草叶片中的表达效果, 可以通过加盖塑料壳来保持湿度。

3.  萤火素酶活性观察

植物活体成像系统定性检测萤火素酶活性。

(1). 2-3天观察取样, 取下叶片背面向上，用含1 mmol·L–1萤火素底物D-luciferin的反应液喷湿叶片背面，或直接用枪滴加在叶片背面; 将叶片在黑暗中静置5-7分钟（图2）。

(2). 将叶片置入植物活体成像系统中检测发光情况。如果有发光, 即说明待测蛋白之间存在互作。为了保证实验的准确性和一致性, 同一株烟草至少选取3个重复进行荧光检测, 此操作重复3次。

(3). 根据实验结果调整曝光强度并拍照(图3)。

图2 萤火素酶互补实验示意图

（引自赵燕等，植物学报，2020）

(A) 选取4周龄完全伸展的烟草叶片进行农杆菌注射, 24–48小时后取样观察(Bar=2 cm); (B) 截取完整的农杆菌注射后的烟草叶片,叶背向上平放于培养皿中(Bar=1 cm); (C) 利用植物活体分子影像系统检测烟草叶片的发光情况并拍照。图中圆圈示农杆菌注射部位。

图3.蛋白质OsXLG2-OsBIK1互作实例

（引自赵燕等，植物学报，2020）

将分别含有CLuc-OsXLG2和OsBIK1-NLuc质粒的农杆菌液1:1体积比混合后注射4周龄烟草叶片, 24–48小时后进行检测, 以CLuc-OsPPI和OsBIK1-NLuc作为负对照。

4. 蛋白检测

(1). 将等量检测后的烟草叶片置于1.5 mL离心管中,加入400 μL蛋白裂解液, 用研磨棒研碎叶片, 或置于研钵中研磨以破碎细胞。

(2). 取破碎后的样品进行离心, 收集上清液, 加入5×蛋白上样缓冲液, 100°C煮5分钟, 离心收集蛋白提取液。

(3). 利用常规方法, 通过SDS-PAGE胶分离蛋白, western-blot (WB)检测蛋白表达。含有NLuc的融合蛋白可以用anti-luciferase抗体检测; 连有CLuc的融合蛋白可以通过anti-CLuc抗体来检测(图4)。

图4. Western blot检测CLuc和NLuc融合蛋白的表达

（引自赵燕等，植物学报，2020）

融合蛋白分别用anti-luciferase和anti-CLuc抗体来检测。

注意事项

(1). 表达载体的选用。融合蛋白质的正确表达是实验成功的关键。首先, 构建的重组质粒要通过测序保证目标基因与报告基因在同一个阅读框; 其次, 由于不同蛋白质在行使功能时空间构象的变化及其在细胞中的定位不同, 需要考虑选择目标蛋白的哪一个末端与报告蛋白进行融合, 如NLuc只能位于目标蛋白的C末端(图1A), 而Cluc既可位于目标蛋白的N末端(pCL) (图1B), 也可以位于目标蛋白的C末端(pCAMBIA1300-CCLuc, pCCL)(图1D)。

此外, 由于anti-luciferase抗体既可以检测NLuc 片段, 也可以检测CLuc片段, 为了更有效地区分NLuc和CLuc融合蛋白, 表达载体pCAMBIA1300-HA-NLuc (pHNL)中增加了3XHA标签, 可直接用HA抗体来检测NLuc融合蛋白的表达(图1C)。

(2). 表达载体的构建。随着克隆技术的不断改进, 受目标基因酶切位点的限制, 推荐大家使用In-fusion反应进行载体构建, 具体方法参阅试剂盒使用说明书(In-Fusion HD Cloning Kit) (Takara, Cat No.639650)。

(3). 正负对照的设定。理论上, 每次实验应该设置正负对照以检测实验体系的可行性。建议选用已经发表的并证明在同一个蛋白复合体中互作的蛋白质对作为正对照; 空载体pNL和pCL不能作为负对照, 因为pNL中NLuc序列起始端没有翻译起始密码子, pCL的CLuc序列末端没有翻译终止密码子; 理想的负对照应该选用与待检测蛋白具有相似的亚细胞定位, 但并不互作的蛋白质, 或者选择没有活性的待检测目标蛋白(如突变后)。

(4). 蛋白检测表达的重要性。判定蛋白之间的互作是建立在融合蛋白都可以正确表达的基础之上, 只有各融合蛋白都正确表达才能判断目标蛋白之间是否存在相互作用。如果待测蛋白没有发生互作, 即使正负对照都正常表达, 应首先利用WB来检测待测目标蛋白质对在瞬时表达体系中是否表达及表达的丰度。

(5). 大规模蛋白质互作的筛选和验证。LCA可以定性检测和定量检测蛋白质的互作。