安徽省农科院开发植物广泛识别非典型PAM序列的SpCas9变体编辑工具盒

来源：植物科学最前沿

2020年12月28日，Molecular Plant 在线发表了安徽省农业科学院水稻研究所魏鹏程团队题为“Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical protospacer-adjacent motif compatibility in plants”的研究论文。

该研究在水稻中利用SpCas9变体NRRH、NRTH和NRCH（R为A/G, H为A/C/T），将SpCas9识别PAM序列扩展至NRNH， 利用SpCas9变体SpG，提供高效稳定的NG PAM识别能力，利用SpCas9变体SpRY，实现几乎不受PAM限制的植物基因组靶向编辑。该研究开发了多种识别非典型PAM序列SpCas9变体植物靶向突变工具及单碱基编辑工具，构建了多用途、简单易用的植物广适性基因编辑工具盒，显著提高了CRISPR-SpCas9系统在植物中的编辑能力。

CRISPR/Cas系统作为强大的基因组编辑工具，已经在许多模式植物和农作物中成功应用。尽管有多种植物CRISPR-Cas编辑工具被报道，来源于链球菌SpCas9因其活性高效稳定，应用最为广泛，也成为CRISPR衍生工具开发的主要平台。但SpCas9仅能识别经典的“NGG”PAM序列，严重限制了基因组上可靶向范围。因此研究人员一直在尝试打破PAM限制。尽管通过改造SpCas9已获得识别不用种类PAM的SpCas9变体， 例如：识别NGA PAM的Cas9-VQR变体、识别NGAG的Cas9-EQR变体、识别NGCG的Cas9-VRER变体、主要识别NG的xCas9和SpCas9-NG变体、以及识别NAA的SpCas9-SmacCas9人工杂交变体iSpyMacCas9等。但这些PAM扩展SpCas9工具编辑范围仍相对有限，因此植物基因组编辑急需开发多样化、效率稳定的SpCas9变体工具。

2020年2月，哈佛大学David R. Liu课题组报道了利用噬菌体辅助连续（非连续）进化技术开发出的三种SpCas9变体，其不受限于必须含G碱基的要求，分别识别NRRH、NRCH和NRTH PAM序列。2020年3月，哈佛医学院Benjamin P. Kleinstiver团队报道了SpG的变体，能够稳定识别NGN PAM， 进一步优化该酶，获得了一种近PAMless SpCas9变体SpRY。SpRY核酸酶和碱基编辑器变体可以靶向几乎所有PAM。

此项研究在水稻密码子优化的SpCas9基础上引入系列关键氨基酸突变，构建了植物SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH、SpCas9-NRTH、SpG和SpRY基因编辑系统（上图），进而通过稳定转化水稻，在愈伤群体中检测比较了这些新型变体的靶向编辑活性。研究利用SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH和SpCas9-NRTH靶向了水稻基因组138个NRNH位点，amplicon-NGS表明这些变体在大部分位点都具有编辑效率，与SpCas9和SpCas9-NG的比较也说明NRRH类变体可编辑传统SpCas9系统难以靶向的植物基因组位点；利用SpG变体及SpCas9-NG分别靶向水稻基因组32个NGN位点， 比较编辑效率表明SpG较SpCas9-NG在NGH 位点效率大部增强，可能更适于植物非典型NG位点的编辑；而利用SpRY也在水稻OsPDS基因上靶向了64个可能的NNN PAM， 在超过半数SpCas9不能识别非典型的PAM位点上， SpRY均能诱导有效突变（编辑效率>5%）。这些结果在再生水稻株系群体中得到了进一步验证

在此基础上，这些SpCas9变体分别与小鼠胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1、人胞嘧啶脱氨酶APOBEC3a及定向进化后的大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶（TadA*-8e）融合，开发了相应的-eBE3，-eA3A和-ABE8e系列植物单碱基编辑工具。所构建的工具盒在水稻基因组多个不同PAM位点实现了C·G::T·A碱基间的定点替换，特别是ABE8e融合的腺嘌呤碱基编辑工具在多底盘、多位点均表现稳定高效介导A-to-G替换， 显示出优良的应用性。该研究在植物系统中有效扩展了SpCas9识别的PAM范围，丰富了植物基因编辑系统类型，也为作物品种改良等提供了更广泛、高效、精准的新工具。

该研究由安徽省农业科学院水稻研究所完成，李娟副研究员和许蓉芳副研究员为论文共同第一作者，魏鹏程研究员为论文通讯作者。相关工作得到了国家自然科学基金联合创新基金、转基因专项、安徽省自然科学基金等的资助。