Protocol：基因枪介导的玉米遗传转化方法

来源：植物生物学

1. 实验原理

基因枪法（Gene gun）又称粒子轰击（Particle bombardment）或基因枪轰击技术（Gene gun bombardment），由美国康奈尔大学生物化学系John.C.Sanford等于1983年研发而成。该方法主要适用于单子叶植物的遗传转化，其基本工作原理是利用氦或氮等压缩气体作为动力系统，将表面吸附有DNA的细微金粉射入细胞，最终到达细胞核完成基因转移，因此无需去除细胞壁和细胞膜。

2. 实验材料

玉米优良品系的幼胚或来源于幼胚的胚性愈伤组织

3. 主要试剂

70%酒精，2.5%次氯酸钠，无菌水，LB培养基，质粒提取试剂盒，无水乙醇，0.1mol/L亚精胺，2.5mol/L氯化钙

4. 培养基配方

愈伤诱导培养基：N6 basic salts，1.4g/L L-脯氨酸，0.1 g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，10mg/L AgNO3，30g/L蔗糖

高渗培养基：N6 basic salts，0.7 g/L L-脯氨酸，0.1 g/L酸水解酪蛋白，2mg/L2,4-D，0.2M甘露醇，0.2M山梨醇，30 g/L蔗糖

恢复培养基：N6 basic salts，0.7 g/L L-脯氨酸，0.1 g/L酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D，20 g/L蔗糖

分化培养基：N6 basic salts，1mg/L 6-BA，20 g/L蔗糖

生根培养基：N6 basic salts，0.5mg/L 6-BA，30 g/L蔗糖

5. 仪器设备

PDS-1000/He型基因枪

6. 实验程序

6.1 材料准备

1. 选取授粉后10天左右的玉米果穗，去除苞叶和玉米须，于超净工作台内依次用70%酒精和2.5%的次氯酸钠分别浸泡消毒5min和10min，再用无菌水冲洗4-5遍。用镊子小心剥取大约1.5-2 mm的幼胚，盾片朝上置于愈伤诱导培养基，28℃/黑暗条件下培养诱导愈伤组织。约2-3周后将诱导出的愈伤组织继代培养，每2周继代一次，至得到胚性愈伤组织。

2. 将幼胚或胚性愈伤组织均匀紧凑地置于高渗培养基上，呈直径大约3-4cm的圆形，8-12h后用于基因枪转化。

6.2 质粒的大量提取

提取用于基因枪转化的合格浓度（1µg/µl）的目的载体质粒，（索莱宝质粒大提试剂盒）提取方法如下：

1. 取-80℃保存的目的大肠杆菌菌种，接种于50mL LB液体培养基（含抗生素），37℃，250rpm振荡培养过夜。

2. 将培养物5000rpm，4℃离心3-5min，弃上清。

3. 加入5mL溶液I重悬，旋涡振荡器上剧烈振荡，使沉淀充分悬浮。

4. 加入5mL溶液II，轻轻颠倒混匀，室温放置2-5min。

5. 加入6mL溶液III，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min。

6. 11000rpm，4℃离心10min，取上清至吸附柱，11000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管（为提高效率，可将收集管中的废液倒入吸附柱再次吸附一次）。

7. 向吸附柱中上加入7ml漂洗液（已加入无水乙醇），11000rpm，离心2min，弃废液，重复该步骤一次。

8. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm，离心2min，收集质粒溶液用于后续实验（为增加质粒回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱再次洗脱）。

6.3 基因枪微弹的制备

1. 称取金粉20mg（直径1.0μm），放入1.5mL无菌离心管中，加入500μL无水乙醇，剧烈震荡1min，使其悬浮静置5min，<3000 rpm离心1min，去掉上清，重复上述步骤3次。

2. 加入500μL无菌水，剧烈振荡1min，静置1min，<3000rpm离心1min，去上清；重复上述步骤3次。

3. 加入500μL无菌水，悬浮后平均分配到10支1.5mL无菌离心管中，可4℃保存。

4. 向离心管中加4μL质粒(1μg/μL)，20μL 0.1mol/L亚精胺和50μL 2.5 mol/L的CaCl2，轻轻吸打混匀，冰浴静置8min。

5. <3000rpm离心1min，去掉上清，加入200μL无水乙醇，重新悬浮，<3000rpm离心1min，重复上述步骤3次。

6. 小心去掉上清，加入50μL无水乙醇，保持悬浮状态备用。

7. 基因枪转化前取10uL点于载体膜中央，使其均匀分布，晾至完全干燥备用。

6.4 基因枪转化步骤

本实验用采用BIO-RAD基因枪PDS-1000/He，方法步骤如下：

1. 打开超净工作台，用70%乙醇擦拭超净工作台和基因枪内部（注意：基因枪门不可用乙醇擦拭，以防损害有机门及封闭圈）。

2. 紫外灯照射杀菌30min。

3. 按前述步骤准备基因枪微弹。

4. 将易裂片、微弹载体、阻拦网及承载微弹载体的铜圈置于70%乙醇中浸泡15min灭菌，之后用滤纸吸干微弹载体表面的乙醇，阻拦网及铜圈在酒精灯上灼烧，置于一个垫有滤纸的无菌培养皿中冷却。

5. 将微载体置于铜圈上，将微弹迅速均匀涂于微载体上，晾干乙醇。

6. 打开压缩气瓶，调节压力至易裂片标准加200psi以上。

7. 将易裂片、阻拦网、微弹载体安装进固定装置中，调整射击参数：Gap distance 20mm；微弹载体飞行距离（Macroprojectile flight distance）：10mm；微弹飞行（Particle flight distance）：7cm；压力：1350psi；真空度：28.5inches Hg（载体置于第一档）。

8. 将培养皿置于托盘上，使待转化材料集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入基因枪倒数第二档。

9. 打开基因枪电源和真空泵。

10. 关闭基因枪门，按下抽真空键（Vac），当真空表读数达到28.5 inches Hg.时，置于“保持（Hold）”档。

11. 按下射击键（Fire），直到射击结束。

12. 按下放气键，使真空表读数归零。

13. 打开基因枪门，取出培养皿，盖好培养皿盖并用封口膜封好。

14. 重复上述步骤，直至完成转化。

6.5 转化后的组织培养

1. 将转化后的幼胚或愈伤组织继续于高渗培养基上，28℃黑暗培养过夜，转移到恢复培养基上培养1-2周。

2. 将愈伤组织转移到选择培养基（添加有相应抗生素）上，每两周选择一次，共选择三次，期间弃去衰老死亡的愈伤组织。

3. 将选择存活的抗性愈伤移至含相应抗生素的分化培养基上，16h光照/8h黑暗，28℃条件下培养，每两周继代一次。

4. 当植株长到1-2cm高时，转移到生根培养基中继续培养。

5. 3-4叶期且根系发达时，将小苗移入花盆中，并罩塑料袋保温保湿，移入温室栽培5-7d后，去掉塑料袋，一周后移入大田，直至开花结实。