NC：TALEN在编辑异染色质靶点方面表现优于Cas9 学术资讯

来源：植物科学最前沿

近日，美国伊利诺伊大学香槟分校赵惠民教授团队在Nature Communications 杂志上发表了一篇给题为“TALEN outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites”的文章。文中通过活细胞单分子荧光显微镜直接观察了dCAS9和TALE蛋白在体内常染色质和异染色质区域搜寻靶标的表现，观察发现TALEN在异染色质区域的编辑效率高于Cas9。

CRISPR-Cas9和TALEN技术作为两种强有力的基因组编辑工具，二者都可以识别自定义的DNA序列，但在靶点的结合机制上存在明显区别。Cas9蛋白在sgRNA的引导下识别具有PAM结构的DNA序列，通过DNA-RNA配对介导靶点结合。而TALEN的DNA结合域由33-34个串联的氨基酸模块构成，每个模块靶定单个核苷酸。体外单分子研究表明TALEs通过“molecular zip-line”机制沿DNA骨架进行靶标位点搜索。而CRISPR/Cas9搜索靶标位点的机制仍不清晰，可能通过3-D diffusion 或沿DNA进行1-D diffusion。

在本研究中，活细胞单分子荧光显微镜被用来观察TALE和Cas9蛋白在搜索靶标过程中的动态变化。作者设计了两个特殊的TALE蛋白：CFTR-TALE在基因组中的结合位点≤4个(该蛋白一直处于搜索靶标状态)，而Alu-TALE则大概有100万个结合位点；同样地，作者还设计了CFTR和Alu的sgRNA。采用两种不同的成像条件对蛋白搜索靶点的动力学进行了分析：短曝光时间（10-20ms）研究快速扩散动力学；长曝光时间（500ms）表征结合分子的停留时间。结果表明TALE蛋白通过local search和3-D diffusion的方式搜索靶标，而dCAS9蛋白则依赖local search的方式。

在单分子层面上，对不同染色质状态下基因组编辑蛋白搜索靶标的机制进行研究，对着丝粒结构的异染色质环境下的TALE和dCas9搜索动力学进行成像，结果表明TALE和dCAS都能观察到“跳跃”（短期的“解离-再结合”事件）行为，但是TALE跳跃的频率仅取决于染色质的紧密程度,而dCas9还会额外地对PAM位点有要求。由此作者推断出一个可能的异染色质中的Cas9和TALE靶标搜索模型，即Cas9被困在结构紧密的异染色质结构中，而TALE通过“跳跃”可以有效地在异染色质中滑动。最后，通过TIDE分析对靶标位点的编辑效率进行计算，结果显示Cas9在4个常染色质位点表现出相似或更高的编辑效率，而TALEN则在异染色质中编辑效率则更高。这一结果进一步证实了TALEN更适用于异染色质编辑。