新研究：计算辅助的非IgG型PD-1/PD-L1蛋白抑制剂的开发学术资讯

来源：ACS美国化学会

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.的文章“Development of a Non-IgG PD-1/PD-L1 Inhibitor by in Silico Mutagenesis and an In-Cell Protein−Protein Interaction Assay”，文章的通讯作者是来自日本理化学研究所的Hideyuki Miyatake教授。在这篇文章中，作者从PD-1/PD-L1的相互作用出发，利用计算机辅助的位点突变筛选，并结合细胞内的PPI互作实验，成功筛选到了尺寸更小的非IgG型PD-1/PD-L1蛋白抑制剂。

PD-1/PD-L1是目前最受欢迎的免疫检查点，抑制PD-1/PD-L1的相互作用是免疫疗法中最成功的案例之一。PD-1/PD-L1的相互作用是通过两个蛋白IgV-like 结构域上的β-折叠结构实现的，其相互作用界面较大且平坦，没有较深的口袋可以容纳小分子，因此，目前用于阻断PD-1/PD-L1相互作用的分子主要为全长的单克隆抗体。虽然已经有靶向PD-1/PD-L1的单克隆抗体成药，但是全长抗体也有其不可避免的缺点。第一，由于表达需要在哺乳细胞体系中进行，全长抗体的生产效率较低，成本较高；第二，由于全长抗体分子量大，导致其难以浸润到实体肿瘤的内部，因而在实体瘤中治疗效果有限。因而，需要开发尺寸更小的，且能在原核表达的蛋白抑制剂来阻断PD-1/PD-L1的相互作用。

目前已有一些研究者开发了基于VHH结构的anti-PD-1/PD-L1的纳米抗体，而本文的作者从PD-1/PD-L1本身的相互作用出发来设计目标分子。WT-PD-1/PD-L1的亲和力在微摩尔水平，可以通过位点突变的方法获得更高的亲和力；另外，PD-1的IgV-like 结构域只有15 kD，并且可以原核表达。基于以上的原因，作者设计了如下策略来筛选具有更高亲和力的PD-1突变体。

图1. 计算辅助的非IgG型PD-1/PD-L1蛋白抑制剂的开发示意图。

首先，针对WT-PD-1/PD-L1的晶体结构，他们在PD-1/PD-L1相互作用界面上选择了一系列位点(Y68, M70, S73, Q75, T76, D77, K78, G124, I126, K131, A132, I134, E136)用于突变。他们采用计算机辅助的位点突变方法，利用ICM-Pro 软件对突变后的结合能进行计算，得到可以提高亲和力的突变位点。然后他们将这些位点在PD-1质粒上进行逐一突变，并且与PD-L1质粒在细胞内共表达，来检测突变体对PD-L1的亲和力是否有提升。在这里，他们用到了NanoBiT (Promega) 筛选体系，这个体系包含两个质粒PD-1-LgBiT (WT or variants) 和 SmBiT-PD-L1。LgBiT 和 SmBiT分别是split-luciferase的两个部分，他们会随着PD-1/PD-L1的相互作用重新组合在一起并催化底物发光，这种发光的强度取决于PD-1/PD-L1的结合强度。因而，这个体系可以用于在细胞内汇报两个蛋白的相互作用强度，从而避免了蛋白纯化带来的困扰。

图2. 计算辅助联合胞内蛋白互作筛选实验流程图。

利用计算的方式联合胞内蛋白互作筛选实验，他们筛选到了A132V, A132L, T76Y三个突变可以有效地提高PD-1对PD-L1的亲和力。将其中两个突变组合，他们得到了新的突变体2-PD-1 (T76Y A132V)，该突变体相较单位点突变体具有更高的亲和性。并且结合动力学实验表明，2-PD-1与PD-L1的结合常数KD为14.52 nM，相较WT PD-1有近100倍的提升，但仍比单克隆抗体nivolumab的亲和力低 (KD为2 nM)。

图3. PD-1突变体的筛选及2-PD-1亲和力测试。

接下来，他们将2-PD-1的IgV-like 结构域在E. coli.体系中表达纯化出来，并对其进行了验证。通过PD-1/PD-L1 结合抑制实验以及T细胞激活实验 (Promega)，他们证明了2-PD1在细胞水平上可以有效抑制PD-1/PD-L1的结合 (IC50为19.2 nM)，并且可以重新激活被PD-L1抑制的T细胞。但2-PD-1的抑制效果不如单克隆抗体nivolumab。最后，他们通过计算模拟的方式说明，T76Y 和A132V突变是通过增加了接触面积的方式提高了亲和力。