JIPB：赖锦盛课题组建立一种适用于高通量转录组和基因型分析的测序文库构建方法学术资讯

来源：JIPB

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RNA-seq能够全面快速地获取特定样品的所有转录本的信息，并且具有基因表达水平检测范围广，技术背景噪音低的优点，目前已经成为了转录组分析的首选方案。常规的RNA-seq文库构建方法较为繁琐，通常包括mRNA的分离，mRNA片段化，反转录合成cDNA第一链，cDNA第二链合成，双链cDNA末端修复和加腺苷酸A，接头的连接，PCR富集等步骤。另外，利用常规的RNA-seq方法构建不同样品的测序文库时，每一个样品都需要独立处理。因此，针对大量样本时常规的RNA-seq方法不仅成本较高，而且费时费力。而实际中，很多的研究都需要对大量样本的转录组进行测序分析，包括绘制不同组织样本的转录组图谱，同一组织样本的转录组动态分析，以及群体中基因表达水平变异和调控分析等。

JIPB近日在线发表了中国农业大学农学院赖锦盛课题组题为“MP3RNA-seq: massively parallel 3ʹ end RNA sequencing for high-throughput gene expression profiling and genotyping”（https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/jipb.13077）的研究论文。该研究建立了一种针对大量样本的转录组文库构建和测序方法。该方法文库构建和测序的总费用约为45 RMB/样品，只有常规RNA-seq方法成本的1/10，适合于高通量的基因表达分析和基因型分析。

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MP3RNA-seq文库构建流程示意图

赖锦盛课题组通过在反转录合成cDNA第一链的过程引入一级条形码，实现了不同待测样品文库在同一实验中的并行构建。通过在反转录合成cDNA第一链的过程引物唯一分子识别码，实现了PCR过程产生的重复序列的有效识别和去除。通过引入一级和二级条形码，以及通过基于转录本3’端对基因表达水平进行检测，实现了文库构建和测序的高通量。基于对玉米、拟南芥、人和小鼠等样品的分析表明该方法具有与常规RNA-seq方法相当的基因表达水平检测准确性和表达基因检出效率。此外，利用MP3RNA-seq方法成功的对一个包含477个DH系的玉米群体进行了基因表达水平和基因型分析，并以此为基础对基因表达调控位点和株高、穗位高和相对穗位高的调控位点进行QTL定位。研究鉴定到了25797个eQTL，其调控15335个基因。此外鉴定到了21个株高、穗位高和相对穗位高的QTL，包括一个落在2号染色体20-30 Mb的QTL，其同时影响这三个农艺性状。