陈洪渊、黄硕团队.：限域孔道内单分子化学反应揭示单分子元素周期律

来源：X一MOL资讯

俄国著名化学家门捷列夫在对已知的元素进行分类整理时发现，元素的理化性质随原子量的递增呈周期变化规律，并据此制作了第一张元素周期表。元素的酸、碱性是其重要的化学性质之一，而酸碱作用规律一直被广泛研究。Lewis酸碱理论对酸碱作了明确的定义：凡是能够接受电子对的物质为Lewis酸，凡是能够给出电子对的物质为Lewis碱。该理论主要用来解释酸碱反应，如：胃酸过多可用碱性的苏打水来中和。然而，该理论对于酸、碱的相对强度没有统一的标度，难以判断酸碱反应的方向。1963年，Pearson在此基础上提出了软硬酸碱理论来弥补此缺陷 [1]。软硬酸碱理论里把Lewis酸、碱进一步的各分为硬、软两大类：体积小、正电荷数高、可极化性低的中心原子称作硬酸；体积大、正电荷数低、可极化性高的中心原子称作软酸；将电负性高、极化性低难被氧化的中心原子称为硬碱，反之为软碱；除此之外的酸碱为交界酸碱。

软硬酸碱理论的中心思想是：在所有其他因素相同时，硬酸优先与硬碱结合，软酸优先与软碱结合。该理论主要用来定性地解释和预测酸碱配位反应的结果，而定量的配位参数（如结合强度）通常由光谱滴定和核磁共振谱测得。这些定性或定量的结果是整体分析得到的，整体带来的平均效应会掩盖单分子个体的行为进而造成一些重要信息的丢失，单分子层面的元素配位行为和规律亟需被揭示。

生物纳米孔，其纳米级别的限域空间和单个分子的尺寸相当，非常适合用来研究单分子间的相互作用。最近，南京大学黄硕团队在工程化的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）纳米孔里观察到单个氯金酸离子与甲硫氨酸残基的配位作用 [2]，相比于常用的溶血素（α-HL）纳米孔 [3-5]，金属离子的阻孔信号被显著放大，表明MspA孔在研究单分子相互作用上具有更高的空间分辨率。利用MspA孔的这一特性，黄硕团队在其限域空间内进行了一系列的酸碱单分子反应探究并首次揭示了单分子尺度上元素间的配位规律符合软硬酸碱理论。

本工作通过改造MspA孔最灵敏的91号位置的氨基酸作为活性配位基团，一系列单原子金属离子和氨基酸残基的单分子配位反应被研究。以MspA纳米孔内组氨酸残基和Zn2+离子的配位作用为说明模型，单个金属离子和氨基酸残基动态的配位过程被实时记录 （图1a, 1b），离子和氨基酸残基的结合导致开孔电流的下降，产生了约10 pA的阻孔信号（图1c）。进一步的数据统计和计算可得到配位相关参数：结合常数（kon = 1/τon[metal ions]）、解离常数（koff = 1/τoff）以及平衡结合常数（Kb = kon/koff ）。至此，MspA纳米孔内的单原子金属离子（酸）与氨基酸残基（碱）的配位系统被成功建立。

图1：MspA纳米孔里单个Zn2+离子和氨基酸残基的配位。a） 实验示意图。单个金属离子和91号位置的氨基酸残基动态的结合和解离。b） 91号位置的组氨酸残基和Zn2+离子的配位。c） 典型的Zn2+离子配位信号展示。（图片来源自论文作者）

MspA孔里91号位置的三类配位氨基酸分别是：天冬氨酸（硬碱）、组氨酸（交界碱）和半胱氨酸（软碱），一系列的金属离子是：Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+（图2），不同的配位组合产生了各自的特征信号，而数据分析得到配位相关参数。平衡结合常数（Kb ）结果表明单分子水平上金属离子和氨基酸残基的配位规律整体符合软硬酸碱理论：硬碱（天冬氨酸残基）和硬离子（Ca2+、Mn2+）的配位作用太弱难以观测到信号，此现象与硬酸-硬碱间易形成离子键，而离子化合物在水溶液会解离成正、负离子，彼此间仅有微弱的静电作用规律是吻合的；交界碱（组氨酸残基）和交界离子（Co2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+）的配位作用相近且强于软离子（Cd2+）（图3a）；软碱（半胱氨酸残基）和软的Cd2+离子配位最强（图3b）。单分子间配位规律的系统性总结将为后续纳米孔内的配位设计提供指导性参考，如预测其他配位反应：软酸离子Pd2+、Pt2+、Hg2+等和软碱的氨基酸残基应有可观测的单分子配位作用。同时，单分子层面的元素配位行为将给宏观的配位研究（如金属蛋白配位）提供了更多的信息。

图2. 单原子金属离子在工程化MspA孔道内的元素周期律探究。（图片来源自论文作者）

图3：限域孔道内的单分子元素周期律。单分子水平上，硬碱（天冬氨酸残基）和硬酸（Ca2+、Mn2+）的作用力弱，难以产生可观测信号；交界碱（组氨酸残基）和交界酸（Co2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+）的配位作用强（图3a）；软碱（半胱氨酸残基）和软酸（Cd2+）和配位作用强（图3b）。单分子间的配位规律符合软硬酸碱理论。（图片来源自论文作者）

值得一提的是，本次研究中也首次实现了生物纳米孔内Pb2+离子的直接传感。Pb2+作为较软的交界酸，其与组氨酸残基、半胱氨酸残基均有配位作用，尤其和半胱氨酸残基的配位更是表现出特征独特的团簇信号（图4），这表明Pb2+与半胱氨酸残基可能有特殊的配位作用。Pb2+中毒的分子机制一直是研究的热点，中毒的原因通常是Pb2+和体内金属蛋白上的活性位点（常见的是半胱氨酸残基）结合使蛋白失去原有功能，导致诸如神经功能紊乱、贫血、免疫力低下等疾病，单分子水平上的Pb2+和半胱氨酸残基的配位行为给Pb2+中毒的微观机理解读提供了重要信息。此外，环境中的铅污染日益严重，铅的检测需求十分迫切。基于本实验中Pb2+离子特殊的单分子信号，未来有望开发出免标记、高特异性的Pb2+离子检测试剂盒。

图4. 单个Pb2+离子和半胱氨酸残基的配位信号展示

该研究成果于近期发表在Chemical Science 上。南京大学化学化工学院陈洪渊院士与黄硕教授为该论文共同通讯作者，南京大学化学化工学院直博生王莎为该论文第一作者。