开发了一种快速可视的核酸检测方法并成功应用于葡萄红斑病毒感染的检测

来源：X一MOL资讯

原标题：基于CRISPR Cas12a与纳米金等离子体的比色识别法实现对葡萄红斑病毒感染检测

全球葡萄种植业和酿酒业每年创造出超过3000亿美元的生产总值，然而葡萄产业的稳定和可持续发展极易受到病毒感染的影响。有效控制葡萄病毒感染需要有应对感染暴发时的快速检测方法和应用于设备受限环境下的常规监测方法。为了满足这种需求，四川大学/加拿大布鲁克大学李峰教授团队成功开发了一种快速可视的核酸检测方法，并成功应用于葡萄红斑病毒感染的检测。

近年来，因新出现的葡萄红斑病（GRBV）感染而造成的经济损失就每年可达2231到68548美元每公顷。葡萄红斑病毒是一种单链环状DNA病毒，初期感染症状并不明显，而且极其容易和其他病毒感染混淆，所以目前最有效准确的检测方法是识别其核酸序列。然而标准的核酸检测方法基本都依赖于大型且昂贵的仪器来产生和读取信号，这限制了对GRBV核酸检测方面的广泛应用。

为了弥补这一遗憾，李峰教授团队研发一种新型的纳米金等离子体CRISPR Cas12a检测方法。与一般的荧光读数方法不同，等离子纳米金是一种可视的比色读数法。检测结果可直接呈现到溶液的颜色上，直接通过变色结果得知是否感染病毒。如下图，感染样品溶液呈现红色，而非感染样品呈现蓝色。通过直接肉眼识别即可得知监测结果，不仅降低了应用的成本，提高了监测的效率，还为条件受限下现场实地监测提供了可能性。

图1. 用于检测葡萄病毒感染的等离子CRISPR Cas12a检测的实验流程。

近几年来， CRISPR领域发展迅猛，其灵活，简单，可调控的特异性使其在基因编辑，生物传感和生物成像等领域成为研究热点。其中CRISPR Cas12a 作为一名在2015年才被发现的CRISPR成员，近年来一直被受关注。特别是在2018年，CRISPR Cas12a被发现在检测到目标核酸序列后，能引发非特异性地切割单链DNA。Cas12a这个附带的单链脱氧核酸酶（ssDNase）的特性可以应用于检测到目标DNA后信号的传导及放大，因此在分析化学领域展现出广阔的应用前景。

图2. CRISPR Cas识别目标序列并激活ssDNase活性。

李峰教授团队利用CRISPR Cas12a的特异性和附带的ssDNase活性，研发出基于等离子纳米金颗粒的灵敏比色读数法。图1显示的是用于分析葡萄样品中病毒核酸的分析方法和实验流程。首先从葡萄样品中提取总核酸，并通过PCR特异性地扩增病毒的DNA序列。该检测方法的序列特异性是由CRISPR RNA (gRNA)提供的，Cas12a蛋白在结合gRNA后，能准确检测到病毒DNA，并激活其附带的非特异的ssDNase活性。为了将核酸检测系统和读数系统连接一起，李峰团队设计了单链DNA底物（S）。S能通过DNA 杂交连接两个不同的DNA修饰纳米金颗粒（AuNP-A和AuNP-B），AuNPs的紧密交联会引发各自的局部等离激元场的耦合，从而导致纳米金溶液发生了红色到蓝色变化。而在Cas12a检测到目标序列之后，能自动粉碎单链DNA底物S，从而阻止S将DNA修饰过的纳米金颗粒交联起来，所以最后溶液呈现红色（分散的纳米金等离子体）。如果Cas12a没有检测到目标DNA，那么底物S就不会受到影响，并能使DNA修饰过的纳米金颗粒产生交联甚至沉淀，所以最后溶液呈现蓝色（团聚的纳米金等离子体）。

图3. Plasmonic CRISPR Cas12a用于酿酒葡萄中病毒检测原理及结果。

该检测方法已成功应用于对葡萄体内病毒感染的快速检测，能准确分析现场采集的真实葡萄样品。该方法与PCR核酸扩增技术结合，检测极限可达到100 aM。由于该方法高度灵敏，即使核酸样品经过2000–10000次稀释，也获得准确的分析结果。因此，该方法能解决现场样品预处理过程中经常发生的大量DNA损失情况。由于S的序列与目标序列无关，因此此系统只需改变gRNA的序列，可以推广到任何目标序列。鉴于其简单可视低成本少限制的优点和准确快速的检测结果，该核酸检测方法还可以广泛应用于对人类疾病和其他农作物感染的快速诊断和实地监测。