叶绿体转基因新策略——“迷你染色体”

质体（主要分为叶绿体、色质体和白色体）基因组工程是具有重要应用价值的研究方向，比起细胞核转基因，质体的转基因具有多重优势，主要包括：1、由于缺乏表观遗传或转录后基因沉默机制，蛋白表达水平高且稳定；2、质体DNA通过母系遗传，几乎不存在转基因不良扩散的风险；3、质体中多为原核性质的转录翻译机制，可以运用多顺反子调控的表达策略等【1-3】。目前质体的转基因一般是通过基因枪投递的策略，然后通过叶绿体转化载体两侧的与靶标序列之间的两个同源重组事件插入到质体基因组内。但叶绿体转化存在一个内源性障碍，即单个细胞的质体存在多拷贝性，这种情况下，为了获得一个稳定的转基因株系，就要通过多轮选择压力，使所有不含有转基因的质体被消除，达到同源质体状态，因此相比于细胞核的基因工程，整个周期较长【4】。

目前，植物病毒已经成功应用于细胞核的外源基因高效表达和植物基因组编辑，但是尚未应用于质体基因组工程【5】，是否可以开发一种不依赖于外源基因插入质体，但在细胞器中可以稳定扩增外源DNA的方法？

近日，法国生物技术公司Algentech总裁兼首席执行官Alexander Sorokin团队在Nature Plants杂志发表了题为Replicating minichromosomes as a new tool for plastid genome engineering的研究论文。该研究提出了一种新的叶绿体转基因导入和表达的方法，不需要插入到叶绿体基因组中，而是创造了一个物理上独立的实体，称为“迷你染色体”。

该研究首先构建了AJTE质体转化载体，包含有质体特异性启动子、甜菜曲顶卷叶病毒（BCTV）复制起始蛋白（Rep）和筛选标记基因aadA（编码氨基糖苷腺苷酰转移酶），该表达载体被称为“迷你染色体”。对照载体AJTB将Rep改换为编码β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的uidA报告基因，烟草的质体转化通过基因枪轰击的方法进行。通过对转化事件的分子检测分析显示，利用载体AJTE转化质体，在没有可检测到的转基因插入的情况下，可以非常有效地扩增外源DNA，表明以双生病毒为基础的扩增系统与质体DNA合成机制存在普遍的兼容性。

为了确定叶绿体转化的特异性，研究人员设计了AJWY载体，该载体中aadA作为可选择性标记，绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，在质体特异性启动子驱动下通过双顺反子调控基因表达；因为AJWY载体不含有同源重组和转基因整合到质体基因组所需的质体靶向区域，因此，只有转基因DNA在细胞器中有效的扩增或者插入到质体中，才可以表现为对壮观霉素的抗性和在叶绿体中表达GFP；研究人员还创制了表达核编码和叶绿体靶向BCTV Rep的转基因烟草株系(nRep)；通过AJWY载体在野生型和nRep株系中的转化，利用表型荧光显微镜检测转基因DNA的扩增和GFP的表达，结果显示，此处的转基因扩增表达在细胞器中发生了。

为了检测和消除细胞核转基因扩增的可能贡献，研究人员设计了AIBW载体，该载体除了包含选择标记和报告基因外，还加上了叶绿体特异性启动子驱动的Rep基因，预计Rep蛋白将直接到叶绿体中表达，运用Sourthern Blot检测“迷你染色体”的信号强度，发现“迷你染色体”在叶绿体中的积累非常有效；随后将9个含有AIBW“迷你染色体”的GFP阳性株系转移到土壤中，评价去除选择性压力后转基因的稳定性，结果显示，使用叶绿体表达的Rep提高了转基因的稳定性。实验中发现AIBW初级转化子在体外显示出漂白表型，并在后代植株中出现严重发育缺陷，为了探究这一毒性表现的原因，研究人员创制了ptRep 质体转化系，其中Rep表达盒被插入到accD和rbcL基因之间的质体基因组中，对ptRep植物的总蛋白分析显示ptRep插入位点和表达盒的组分可能影响了内源蛋白的表达；随后研究人员构建了AIDR载体，包含GFP报告基因和npt II（编码新霉素磷酸转移酶II）筛选标记基因，用AIDR转化ptRep转基因株系，通过表型荧光显微镜检测和Sourthern Blot对“迷你染色体”信号强度分析，发现尽管“迷你染色体”积累很高，但是恢复后的初级转化子仅显示轻微的黄化表型。

Phenotype of minichromosome lines

为了进一步评估选择性压力是否是“迷你染色体”遗传所必需的，选取合适的种子并观察所有后代幼苗的抗药性，表明在有选择性压力和无选择性压力条件下，所有品系均检测到非常高数量的“迷你染色体”遗传，同时发现尽管ptRep AIDR转基因植株数量较多，但是其子代可育且体外表型缺陷并不明显，并且在土壤中生长时比AIBW转化植株缺陷症状较轻；为了进一步证实叶绿体中存在“迷你染色体”，利用转基因花粉给WT植株授粉，产生了对卡那霉素敏感的二代后代，证明了AIDR转基因的母系遗传，这些结果均证实了“迷你染色体”在叶绿体中的积累和表达。

为了评估“迷你染色体”驱动和传统质体驱动基因表达的差异性，研究人员创制了AIIS植株系，在质体中的trnl和trnA基因之间插入与“迷你染色体”相同的表达盒。通过Sourtern Blot检测分析，结果显示，与AIIS插入系相比，在温室条件下，“迷你染色体”策略的蛋白积累增加更为明显，这表明“迷你染色体”可以作为叶绿体中基因表达的有效工具。

综上所述， 该研究证明了“迷你染色体”可以作为植物中蛋白表达的模板，不仅缩短了筛选过程，而且减弱了转基因过程对蛋白表达的不利影响。更重要的是，这一策略为至今为止无法进行细胞器修饰的生物体开发质体转化方法提供了借鉴，在生物技术和合成生物学中具有广泛的应用价值。

参考文献：

【1】Kuroda, H. & Maliga, P. Complementarity of the 16S rRNA penultimate stem with sequences downstream of the AUG destabilizes the plastid mRNAs. Nucleic Acids Res. 29, 970–975 (2001)

【2】Ruf, S., Karcher, D. & Bock, R. Determining the transgene containment level provided by chloroplast transformation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 6998–7002 (2007).

【3】Long, B. M. et al. Carboxysome encapsulation of the CO2-fxing enzyme Rubisco in tobacco chloroplasts. Nat. Commun. 9, 3570 (2018).

【4】Bock, R. Genetic engineering of the chloroplast: novel tools and new applications. Curr. Opin. Biotechnol. 26, 7–13 (2014)

【5】Lozano-Durán, R. Geminiviruses for biotechnology: the art of parasite taming. New Phytol. 210, 58–64 (2016).