质体基因组工程新策略：微型合成质体的开发

    虽然目前可以有效地整合相对较小的结构到质体中，但通过转基因同源重组进行的质体工程已经有超过30年的历史。

    近日，植物学权威期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为《Mini-synplastomes for plastid genetic engineering》的研究论文，作者开发了一种不会干扰原生质体的新型合成基因组结构的设计-构建-测试平台：微型合成体，有望彻底改变叶绿体生物技术，使简单的无标记质体工程成为可能，并为植物的一步代谢工程提供一个无与伦比的平台。

    随着植物合成生物学的出现，为快速增长的人口确保全球粮食供应的需求，叶绿体工程再次成为满足这些需求的潜在解决方案。

    比如在可食用植物细胞中表达的治疗性蛋白已被FDA批准用于注射和口服输送，为推进叶绿体中制造的蛋白质药物铺平了道路。

    此外，叶绿体工程分子已被验证用于开发口服增强疫苗，以延长对传染病的免疫力，消除了对冷藏和运输的需要。

    同时，叶绿体生物技术为异源蛋白提供了非常高的产量上限（总叶蛋白高达70%），远远超过了传统的植物核基因组基因工程的潜力。

    第一个在植物中开发的微型合成质体是在体外开发的，符合以下标准：1）质体中附加型的复制；2)易于克隆；3)质体中可预测的转基因表达；4)载体序列不整合到内源性原生质体中；5)在没有外源选择压力的情况下，植物具有自主持久性。

    本研究的目的是开发一个称为微型质体的结构，能够表达用于选择和可视化的转基因，而不需要将异源序列整合到原生质体中。

    此外，微型合成质体必须在没有选择的情况下持续多代。

    该研究首先构建具有长同源臂的第一代Gen1载体，作为微型合成质体设计-构建-测试周期的第一步。

    作者以马铃薯作为转化受体，设计了一个与烟草最常见的转基因整合位点trnI/trnA具有同源性的质体工程载体。

    为了包含烟草中最可能的附加型质粒复制成分(NICE1和ori1和A2和A1)，使用了~2.8和~4.6kb的长同源臂，此外将一系列单核苷酸多态性(SNPs)和一个多克隆位点(MCS)引入同源臂中，以提供更多的标记来识别重组位点。

    为了进行转基因品系的选择，我们将一个常见的双选择盒(aadA和smGFP)克隆到Gen1的trnI/trnA位点上。

    作为HR介导的叶绿体生物技术的对照载体PSSC，包括具有靶向小单拷贝区域(SSC)内的ndhG/ndhI整合位点的~1.8和~5kb同源臂，并使用相同的双选择盒。

    图一 Gen1载体设计利用生物学方法将Gen1结构转化马铃薯叶片，壮观霉素筛选后产生了大量的转基因芽。

    分子实验证实，在Gen1结构中，67%的转基因芽将转基因盒整合到原生质体的trnI/trnA位点，在剩余的芽中，在5株含有Gen1的植物中，通过PCR在其中的2株中扩增出KanR基因，暗示存在一个附加型复制质粒。

    剩余3个株系猜测是由于重组到一个未检测到的位点。

    对照载体pSSC中转基因盒正确整合到所有转基因系的ndhG/ndhI整合位点，没有检测到附加型质粒。

    利用Southern blots和PCR分析总叶片基因组DNA，通过使用两种不同的探针（IR 和aadA）进行Southern blot证实，在含有Gen1游离体的植物中没有检测到转基因整合到原生质体的trnI/trnA位点中。

    接着，作者分析了从叶片组织中提取的第一代附加型单元(eGen1)的特征。

    通过在大肠杆菌中回转分离包含在选定转基因系的叶绿体中的附加体。

    不出所料，在使用从含有附加型Gen1骨架的植物中分离的总基因组DNA进行细菌转化后，回收含有质体的菌落表明Gen1附加体骨架在质体中持续存在。

    通过将初始Gen1构建体的序列与从稳定转化质体(eGen1) 的全植物基因组DNA中分离的质粒序列进行比较，可以跟踪Gen1同源臂内的重组事件。

    eGen1的序列分析证明了同源臂和内源原生质体之间的许多重组事件。

    eGen1游离体在植物多个发育阶段作为外质体DNA保持不变。

    在组织培养中保留的植物中，我们发现eGen1的平均拷贝数约为单拷贝，并在连续的组织培养代中持续存在。

    此外，在无选择压力的条件下，通过盆栽植物的开花，可以从各个生活史阶段分离到eGen1。

    随着时间的推移，每个质体中eGen1的平均拷贝数从2周时的2.04±0.56转移到4周时的3.91±1.44，然后在整个植物的剩余生命周期中，稳定在每个质体的~2.5拷贝。

    质体基因工程的微型合成质体（Gen2）的设计实验证明在组织培养和不同的植物发育阶段，eGen1的序列分析显示序列没有变异，证实了稳定的附加型结构。

    在第一次实验的基础上，为了实现不整合外源DNA的叶绿体工程的最终目标，作者对eGen1进行改造，通过在载体骨架两侧插入双选择盒而不是同源臂，直接从外源片段结构中表达转基因。

    将改造的载体转化马铃薯后发现含有eGen2质粒的合成体系作为不整合的外体单位，具有完整的转基因骨干结构。

    与eGen1相比，除M1和M35外，eGen2的同源臂完全由马铃薯特异性序列组成。

    利用微型合质体株系的cDNA进行RT-qPCR表明，eGen2在叶绿体中具有较高的smGFP和aadA表达，并且发现在所有植物发育阶段都具有高拷贝数。

    总的来说，在这项研究中作者开发了一个新的依赖于小合成基因组的质体基因工程平台，通过设计整合质体结构，其中所需的转基因通过HR整合到原生质体中，而筛选标记基因在质体结构上表达。

    虽然这不是第一次尝试使用外载体进行质体工程，相较于前人最显著的进展是在去除筛选后的多代持久性。

    对eGen1和eGen2转化植物的表型分析表明，在叶绿体工程中使用微型合成质体策略没有适应度损失，再次证明了该方法的实用性。

    另一个进展是定量分析了在整个植物中构建的转基因表达。

    研究工作表明，附加型载体的构建能够表达标记基因而不整合。

    基于这项工作结果，微型合成质体为传统的基于HR的质体工程的替代方案提供了重要的前景。

    对叶绿体生物技术来说，在不需要将外源DNA整合到宿主基因组中的情况下表达转基因的能力代表了一种范式的转变。

    从本质上说，这项工作展示了一种显著改进质体工程现状的新技术，这将使植物的合成生物学成为可能。

    未来通过使用来自不同生物体的叶绿体特异性ori 进一步完善附加型策略，并使用具有不同活性的单个或多个ori 可以精确调整附加型构建体的拷贝数，为复杂通路中的基因表达调控提供另一条思路。