冯小琦课题组揭示了植物生殖细胞特异DNA甲基化重编程分子机制

2021年7月2日，英国约翰英纳斯研究所(John Innes Centre)冯小琦课题组在国际顶级学术期刊 Science 杂志发表了题为“Nurse cell- derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis”的研究长文，揭示了植物生殖细胞特异DNA甲基化重编程的分子机制。

研究背景

被子植物生殖发育过程雄性生殖细胞经历DNA甲基化重编程：除了整体DNA甲基化水平发生变化外，基因组的一些局部位点会发生de novo DNA 甲基化(de novo DNA methylation)。DNA甲基化重编程过程对植物生殖发育至关重要。冯小琦实验室2018年的研究结果表明，雄性生殖细胞DNA甲基化除了发生在转座子(TE)外，也会出现在基因(gene)上，从而调控靶标基因表达，影响减数分裂过程。虽然生殖细胞中de novo DNA甲基化是受RNA介导的DNA甲基化途径(RNA-directed DNA methylation pathway, 简称RdDM)调控，但是，RdDM途径在植物各个组织中广泛表达且主要用于沉默转座子。因此，RdDM如何作用在生殖细胞基因上仍然是一个谜。研究这个机制不仅影响我们对植物的跨代表观遗传的理解至关重要，而且直接影响我们对RdDM途径是如何在细胞水平作用的认识。

主要研究结果

为了解雄性生殖细胞中特异DNA甲基化形成的原因，研究人员首先分离了雄性减数分裂细胞(male meiocyte，图1)，并构建了小RNA (sRNA)文库。sRNA-seq的分析结果发现，减数分裂细胞中绝大多数(~94%)24-nt sRNA只来源于大约800个位点，这与体细胞大为不同，表明减数分裂细胞sRNA发生了重编程。进一步分析发现这800个位点绝大多数与转座子重合，且被高度DNA甲基化，因此研究人员把它们命名为HyperTE。然而，令人不解的是，对于发生在基因区间上的DNA 甲基化位点(命名为MetGene)，却几乎检测不到24-nt sRNA的存在。那么，MetGene 上的DNA甲基化又是如何形成的呢？

图1：拟南芥雄性细胞减数分裂示意图

深入分析发现，HyperTE 与MetGene 位点存在一定的序列相似性。当24-nt sRNA 允许3个以下碱基错配时，MetGene上就有显著的sRNA富集信号。接下来，CRISPR技术敲除HyperTE的实验证实了来源于HyperTE的24-nt sRNA通过允许错配的方式反式(trans) 催化MetGene 上的DNA甲基化。

RdDM需要Pol IV 和 Pol V两个重要的RNA聚合酶参与。Pol IV 被招募到富含DNA甲基化的区域催化24-nt sRNA前体的合成，24-nt sRNA 被装载在AGO 蛋白后，被招募到Pol V转录产生的长非编码RNA处，最终促成DNA甲基化。因此，RdDM 是一个正反馈调节过程。减数分裂细胞中MetGene位点存在较高DNA甲基化，却鲜有24-nt sRNA产生，暗示着减数分裂细胞中Pol IV 可能不工作。那么如果减数分裂细胞自己不产生24-nt sRNA ，其来源于何处呢？研究人员把目光转向了环绕在减数分裂细胞周边的绒毡层细胞上(tapetum)，因为先前研究表明，绒毡层细胞与减数分裂细胞存在大量胞间连丝，这为sRNA的转移提供了理论上可能。

为了验证这一假设，研究人员首先构建了绒毡层细胞特异表达启动子驱动的GFP的株系(pTP::GFP，图2)，利用流式细胞分选技术(FACS)，分离出了纯和的绒毡层细胞。绒毡层细胞的DNA甲基组测序结果表明, 与减数分裂细胞类似，绒毡层细胞在HyperTE位点的DNA甲基化程度很高。sRNA-seq 数据进一步显示绒毡层细胞24nt-sRNA的分布模式和减数分裂细胞十分相似。以上结果为支持sRNA 从绒毡层细胞转移到减数分裂细胞的假设提供了初步证据。为了进一步证明绒毡层细胞产生的24-nt RNA 可以转移到减数分裂细胞催化DNA 甲基化，作者构建了pTP::RDR2 rdr2遗传镶嵌株系(RDR2 负责将单链Pol IV 转录本转换成双链，是24-nt sRNA 合成不可或缺的因子。此株系中，只有绒毡层细胞具有产生24-nt sRNA 的能力)。pTP::RDR2 rdr2 减数分裂细胞甲基组测序结果显示，相较于rdr2突变体中DNA 甲基化完全丢失，该株系在HyperTE 和MetGene位点的DNA甲基化能恢复到野生型水平。以上结果证明了绒毡层细胞产生的24-nt sRNA能够充分介导减数分裂细胞的DNA 甲基化。

图2：绒毡层细胞特异表达启动子驱动的GFP的株系表达图谱，TP: 绒毡层细胞

那么导致绒毡层细胞出现大量24nt-sRNA的原因是什么？研究人员发现，HyperTE位点与已经发表的染色质重组蛋白CLSY3 依赖的位点高度重合，而与CLSY1，CLSY2 和CLSY4 依赖的位点很少关联。CLSY1/2/3/4是CLSY 家族四个蛋白，他们都能够与Pol IV 直接互作, 决定Pol IV被招募到基因组的特定位置。基于此，研究人员猜想减数分裂细胞中24-nt sRNA 是由CLSY3介导产生的。为了证实这一猜想，研究人员首先分析了不同细胞和组织CLASSY家族转录本的表达情况，发现只有CLSY3在绒毡层细胞中高度表达。pCLSY3::Venus-CLSY3报告株系结果显示，CLSY3蛋白在雄蕊中的绒毡层细胞中特异表达，这与转录本分析结果一致。进一步分析结果显示，野生型减数分裂细胞24-nt sRNA富集在CLSY3依赖的位点，而不在CLSY1，CLSY2 或CLSY4 依赖的位点。当CSLY3缺失(而非其他CLSY家族成员缺失)才会导致减数分裂细胞中HyperTE 和MetGene 位点上24-nt sRNA 丰度和DNA甲基化的丢失。综合以上结果，证明CSLY3是导致生殖细胞特异DNA甲基化出现的根本原因，也再次印证了减数分裂细胞中24-nt sRNA来源于绒毡层细胞。

clsy3突变体精子的甲基组数据显示，HyperTE 和MetGene 上DNA甲基化缺失; 而pTP::RDR2 rdr2精子中上述位点DNA甲基化程度与野生型相当。以上结果表明绒毡层细胞产生的24-nt sRNA 不仅驱动减数分裂细胞中DNA甲基化，同样也介导在精子中的DNA 甲基化(该阶段绒毡层细胞已经消亡)。文章的最后，研究还发现，绒毡层细胞产生的24-nt sRNA负责维持逆转录转座子Gypsy1 的沉默状态。

一图解文

本研究系统地揭示了拟南芥雄性生殖发育过程中，绒毡层细胞表达的CLSY3在HyperTE 位点催化产生大量24-nt sRNA，随后被转移到减数分裂细胞中，介导HyperTE和MetGene上DNA甲基化的形成，最终调控靶标基因表达和维持生殖细胞基因组的稳定性。这一发现不仅诠释了RdDM通过特别招募Pol IV 及sRNA碱基错配形成细胞特异的甲基化模式的分子机制，而且翻开了被子植物跨代表观遗传机制的新篇章。

主要作者介绍

英国约翰英纳斯研究所冯小琦研究员为本论文的通讯作者(http://www.jic.ac.uk/people/xiaoqi-feng/)，博士后龙金成，James Walker 和佘文静为文章共同第一作者。本研究由欧洲科学院(European Research Council, ERC)，英国生物技术与生物科学研究委员会 (Biotechnology and Biological Sciences Research Council, BBSRC)以及约翰英纳斯基金会 (JIC Foundation)资助。

来源：PlantBiotech 植物生物学