ACS Chem. Biol. | 化学蛋白质组学发现蛋白质甲基转移酶抑制剂的新靶点

供稿：郭玮明，北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chem. Biol. 的文章，题目是“Chemoproteomic Study Uncovers HemK2/KMT9 As a New Target for NTMT1 Bisubstrate Inhibitors”，通讯作者是普渡大学的 Rong Huang。在这篇文章中，作者设计了蛋白质 N 端甲基转移酶1（NTMT1）的抑制剂 NAH-C3-GPKK，并将其生物素化，作为探针寻找 NAH-C3-GPKK 的其他靶标蛋白质。作者发现除 NTMT1 以外，NAH-C3-GPKK 也可以抑制甲基转移酶复合物 HemK2–Trm112（又名 KMT9–Trm112）的活性，这是首个被报道的 HemK/KMT9 的抑制剂。这项工作也为开发甲基转移酶的选择性抑制剂奠定了基础。 

蛋白质的甲基化调控了各种各样的生物功能，例如转录、DNA 修复、RNA 代谢等等。细胞中蛋白质的甲基化则依赖于各种各样的蛋白质甲基转移酶（MT）。不同的甲基转移酶有不同的功能：有蛋白质 N 端的甲基转移酶（NTMT），有赖氨酸的甲基转移酶（PKMT），还有精氨酸的甲基转移酶（PRMT）。甲基转移酶的失调和许多疾病有密切的联系，高特异性的甲基转移酶抑制剂对于研究甲基转移酶的生理和药理功能至关重要。 

NTMT1 甲基转移酶的底物包括着丝粒组蛋白 H3 变异体 CENP-A/B、染色质凝聚调节因子1、DNA 损伤结合蛋白2等等，在染色体分离、有丝分裂和 DNA 损伤修复中起到了重要的作用。NTMT1 的敲除增加了乳腺癌细胞系对依托泊苷和 γ 射线治疗的敏感性，但是会导致小鼠的发育缺陷和过早衰老。

图 1. NTMT1 的双底物抑制剂

作者针对 NTMT1 设计了一系列双底物抑制剂（图 1），抑制剂的 NAH 部分可以模拟辅因子 S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM），占据 NTMT1 的 SAM 结合位点，抑制剂的多肽部分则模拟其底物，占据 NTMT1 的底物结合位点。作者设计测定了它们对于 NTMT1 的抑制效果，发现其中 NAH-C3-GPKK（inhibitor1）有很好的抑制效果，并且对于 NTMT1 有很好的特异性。作者还解析了 NAH-C3-GPKK 和 NTMT1 复合物的晶体结构，确认了抑制剂与 NTMT1 辅因子结合位点和底物结合位点的结合模式。

图2. 基于 NAH-C3-GPKK 结构设计的亲和探针（probe 6）

作者随后尝试着将此抑制剂改为亲和探针，判断此抑制剂的特异性并寻找其它潜在的靶标蛋白。共晶结构显示 NAH-C3-GPKK 肽段部分末端的最后一个 K 会暴露在溶剂中，仅有其骨架存在和 NTMT1 的相互作用。基于此，作者在 GPKK 的 C 端引入了具有炔丙基的甘氨酸，再利用点击化学反应为其修饰上生物素基团（图 2），此生物素化的探针可以被固定在链霉亲和素微珠上。固定在微珠上的探针依然保持了它和 NTMT1 的强烈相互作用，700 mM NaCl 也未能将 NTMT1 洗脱下来。说明探针可以从细胞中富集与之具有相互作用的蛋白质并且能够去除大量吸附以及弱相互作用蛋白质。作者用固定在微珠上的探针从 Hela 细胞裂解液中富集与之具有相互作用蛋白。利用质谱技术，他们鉴定到了 23 种蛋白质（图 3 以及表 1）。其中除了 NTMT1 之外，仅有一种甲基转移酶 HemK2（又名 KMT9）及其结合蛋白 Trm112。HemK2 是催化亚基，Trm112 是激活亚基，二者可以结合形成甲基转移酶复合物，它可以甲基化组蛋白 H4 的赖氨酸以及释放因子 eRF1 的精氨酸，HemK2/KMT9 包含 SAM 结合位点和底物结合位点，后续验证实验也表明此抑制剂能够有效抑制 HemK2/KMT 的活性。HemK2/KMT9 会在前列腺癌细胞过度表达，敲低 HemK2/KMT9 的表达强烈降低了前列腺癌细胞系的增殖。考虑到 HemK2/KMT9 对前列腺癌的影响，HemK2/KMT9 的抑制剂可能对于前列腺癌的具有潜在的治疗效果。这是第一个被报道的 HemK2/KMT9 抑制剂，为后续开发特异性的 HemK2/KMT9 甲基转移酶抑制剂奠定了基础。

表 1. 化学蛋白组学鉴定到的蛋白质

图 3. 化学蛋白组学鉴定到的蛋白质

总而言之，作者基于 NTMT1 的双底物抑制剂 NAH-C3-GPKK 设计了亲和探针，并进行了化学蛋白组学的研究。此探针仅仅富集到了唯一一种其他甲基化转移酶 HemK2/KMT9，体现了 NAH-C3-GPKK 的高特异性。同时，NAH-C3-GPKK 也是第一个被报道的 HemK2/KMT9 的抑制剂，为后续对 HemK2/KMT9 甲基转移酶的研究以及新的甲基化转移酶抑制剂的开发奠定了基础。