实时活细胞荧光共振能量转移技术用于测定SARS-COV-2结合能力学术资讯

ACE2是新冠病毒S蛋白结合的主要受体，TMPRSS2介导对S蛋白的切割，其他宿主因子如特定细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖、CD4等可能也参与了宿主S蛋白ACE2复合体形成，但这些宿主因子的确切作用还有待确定。已有的研究表明抗ACE2抗体、多肽抑制剂、小分子等可能是具有前景的治疗方案，特别是高通量筛选抑制RBD-ACE2结合的小分子（见前期推送小分子药物可阻断新冠病毒RBD与ACE2受体结合）。然而大多数研究都是体外筛选，未考虑到细胞环境的影响。近日，Cell Chemical Biology的一项研究开发了可用于在活细胞内检测RBD-ACE2复合体结构变化的时间分辨荧光共振能量转移方法(TR-FRET)，为高通量筛选有效抑制剂提供实验平台。

ACE2受体偶联DNA烷基转移酶标记上铽元素，可以将能量转移至RBD-d2萤光团，激发荧光。TR-FERT技术揭示了ACE2-RBD解离常数Kd约2.3nM，具有高亲和力和特异性。研究者利用TR-FERT鉴定能够用于干扰RBD-ACE2复合体的分子，竞争结合试验显示原RBD pKi常数为7.7，未标记多肽抑制剂LCB1v3 pKi常数为9.4，中和抗体IC50为5.1ug/mL。柯里拉京在100uM时能够表现明显抑制效果。

此外该技术还可用于探究内源因子对ACE2/RBD结合的影响，研究者共表达TMPRSS2和ACE2，发现TMPRSS2存在导致TR-FERT信号明显减弱，但RBD-ACE2的动力学常数和亲和力都未发生明显变化，TMPRSS2诱导了明显的蛋白构象变化。而硫酸乙酰肝素蛋白多糖则部分抑制了RBD-ACE2结合，IC50约96ug/mL。硫酸乙酰肝素蛋白多糖别构诱导RBD构象改变，稳定RBD-ACE2的开放型构象。CD4也明显减弱了ACE2-RBD结合，结合速率降低了3.3倍。