刘耀光院士团队开发精短型小核RNA启动子，为植物多基因编辑提供有力工具

来源：BioArt植物

CRISPR/Cas9介导的多基因编辑为植物功能基因组学和作物育种提供了重要的工具。同时进行多基因（多靶点）编辑在基因功能研究和作物遗传改良有重要作用。在植物的多靶点编辑策略主要有两大类：（1）在CRISPR/Cas9载体中连接上多个独立的小核RNA U3/U6启动子驱动的sgRNA表达盒，每个表达盒独立转录产生一种sgRNA。但此策略受限于植物U3/U6启动子长度较大，使得整个表达盒也比较大，即使利用连接效率较高的“金门（GoldenGate）”方法同时连接较多表达盒（>10）时，其克隆效率很低；（2）在一个U3/U6启动子驱动下串联连接sgRNA-linker-sgRNA-lingker-sgRNA…重复单元，转录产生串联的原始转录本（这里的linker是能够自催化的核酶或被剪切的pre-tRNA，内含子序列等)，但其局限性（风险）在于当串联的sgRNA-linker重复单元较多（如>10）时，U3/U6启动子能够产生全长RNA的能力有限，排列在后面的sgRNA单元可能得不到高效转录。因此，创建长度较短且转录活性相当或更强的U3/U6启动子，可以减少每个sgRNA表达盒的长度，提高构建多靶点sgRNA载体的效率。

近日，Science China Life Sciences在线发表了华南农业大学刘耀光院士团队题为Shortened snRNA promoters for efficient CRISPR/Cas-based multiplex genome editing in monocot plants的研究论文。该研究在野生型水稻U3/U6启动子基础上，开发了一套更精干短小的启动子（mOsU3, mOsU6a, mOsU6b和mOsU6c），利用这些启动子和Golden Gate连接方法，单轮连接克隆可以实现多达20个sgRNA表达盒的组装，利于进行多靶点多基因的同时编辑，为植物多基因编辑的实现提供了强有力的工具。

单子叶植物U3和U6启动子在近3’端含有一个保守的TATA box元件，紧接其5’上游有一个保守的USE (upstream sequence element) 元件，以及在USE上游区域分散存在3~4个MSP (monocot-specific promoter element, RGCCCR, R=G,A)元件。这些保守元件是U3/U6启动子活性所必需的，其中TATAbox和USE的相对位置较固定（间隔24~25 bp），但USE上游区域的多个MSP的位置不确定（图1A）。因此，作者基于前期开发的植物多靶点编辑系统，对驱动sgRNA转录的OsU3, OsU6a, OsU6b, OsU6c启动子（长度380~740 bp）进行了人工改造：（1）其3’→5’方向依次保留有1个TATA box保守元件，1个USE保守元件，以及至少一个MSP保守元件；（2）去除5’端上游部分序列，使启动子长度缩至170~223 bp；（3）通过将5’端序列某些位置改变1、2碱基创建若干个MSP元件。通过上述操作，获得了精短型小核RNA启动子mOsU3, mOsU6a, mOsU6b和mOsU6c。

进一步研究表明，精短型U3/U6启动子的转录活性和作用的水稻基因组编辑效率与野生型U3/U6启动子的活性和效率相当或更高（图1B和C）。由于其长度较短，大大减少了每个sgRNA表达盒的长度，提高了多靶点sgRNA克隆构建载体的效率。与利用野生型U3/U6启动子驱动sgRNA的多个表达盒的较低克隆效率相比，使用短小型启动子在单轮GoldenGate连接中可以实现多达20个sgRNA表达盒的组装（图1D）。这套启动子将在单子叶植物的多基因编辑研究和遗传改良中发挥重要作用。

图1  野生型与截短型小RNA启动子结构与编辑效率、克隆效率的比较 A：小核RNA基因的野生型启动子和改造的截短型启动子的结构。MSP单子叶特异性启动子元件；USE，保守的上游序列元件；TATA box，保守的TATA box元件；B和C：野生型与截短型小RNA启动子编辑效率比较；D：不同数量的野生型或短小型启动子驱动sgRNA表达盒的克隆效率比较

华南农业大学刘耀光院士团队硕士研究生郝雨和博士研究生宗伍辈为论文共同第一作者，刘耀光院士和郭晶心研究员为共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金和广东省基础与应用基础研究重大项目的资助。

论文链接：

http://engine.scichina.com/publisher/scp/journal/SCLS/doi/10.1007/s11427-019-1612-6?slug=fulltext