Cell ：半胱氨酸毒性导致衰老相关线粒体减少

来源：BioArt

撰文 | 秋枫

线粒体是细胞代谢的中心【1】，它们能产生ATP、氨基酸、核苷酸、铁硫簇（iron-sulfur cluster, ISC），参与脂肪代谢，促进氧化应激信号，参与天然免疫和细胞凋亡等重要的细胞信号途径。线粒体减少是衰老以及衰老相关疾病的一个重要特征【2】，然而，在衰老过程中，导致线粒体减少的原因却仍旧未知！

近年来，在出芽酵母中的研究显示，溶酶体样液泡（lysosome-like vacuole）的恶化是酵母菌复制衰老过程中的一个早期事件，而液泡酸化的消失则是导致线粒体功能异常的原因之一【3】。液泡是一种酸性细胞器，它能促进蛋白质降解、代谢信号以及代谢物分区【4】。液泡的功能需要一种定位在液泡膜上的蛋白复合体V-ATPase（vacuolar-H+-ATPase），它能在液泡膜内外产生质子梯度，进而使液泡酸化【5】。最近的研究表明，在衰老过程中，线粒体健康的维持需要液泡的酸化，两种细胞器之间存在物理和功能上的紧密联系【6】，不过，这种联系的具体机制目前仍是未知的。

2020年1月23日，美国犹他大学医学院的Adam L. Hughes课题组在Cell杂志发表了文章Cysteine Toxicity Drives Age-Related Mitochondrial Decline by Altering Iron Homeostasis，发现在出芽酵母中，溶酶体样液泡通过在空间上分隔氨基酸从而维持了线粒体的功能，而液泡功能的损伤则会破坏细胞内氨基酸平衡，最终导致衰老相关的线粒体减少。

已有研究报道，在出芽酵母中，线粒体功能和结构的维持需要液泡的酸化，而使用V-ATPase抑制剂concA（concanamycin A）则能抑制出芽酵母在以甘油为碳源的培养基上的生长，因为这时候酵母菌需要线粒体呼吸。为了研究这种现象背后的机制，研究人员利用一种高拷贝质粒基因组DNA库（high-copy plasmid genomic DNA library）去寻找酵母菌无法生长的抑制因子。最后，研究结果显示，过表达FET4能够使酵母菌在甘油培养基上生长。同时，敲除FET4的转录抑制因子ROX1同样能使酵母在甘油培养基上生长。FET4是一种金属通透酶，在出芽酵母中，它能促进低亲和力铁的吸收。因此，和FET4过表达类似，补充外源性的硫酸亚铁铵同样能够拯救出芽酵母在甘油培养基上的生长。

以上研究表明，抑制V-ATPase会导致铁缺乏，那么，缺铁是否是导致线粒体功能异常的原因呢？为了探究这个问题，研究人员找到了调控铁代谢的一个转录因子Aft1，它在缺铁的情况下会转位到细胞核中并诱导一系列统称为铁调控子的基因的表达。通过GFP荧光示踪，研究人员发现，抑制V-ATPase后30 min，Aft1便开始向细胞核中转运。与之类似，使用铁螯合剂BPS（bathophenanthroline disulfonate）同样能使Aft1向细胞核中转运。抑制V-ATPase同时敲除AFT1后，出芽酵母无法生长，而补充铁则能拯救出芽酵母因V-ATPase抑制和AFT1敲除而造成的致死现象。

Aft1感受细胞中的铁含量主要是通过监测铁硫簇（ISCs）的含量来实现的，而铁硫簇是由线粒体中的铁和半胱氨酸产生，它是线粒体内一些呼吸关键蛋白的共作用因子。研究人员发现，在出芽酵母中抑制V-ATPase时，含有ISC的一些酶，比如Aco1（aconitase，顺乌头酸酶）的含量下降了，同样的，线粒体呼吸链复合体中的另外两个酶Sdh2和Rip1的含量同样下降了，而补充额外的铁则能拯救它们的下降。最终，这些关键酶功能的缺失导致线粒体呼吸受损，氧消耗下降。

接下来，研究人员想要探究清楚V-ATPase依赖的细胞功能是怎样维持铁平衡以及线粒体呼吸的。V-ATPase活性主要在三个方面起作用，一是Fet3依赖的铁吸收系统，二是自噬和囊泡依赖的蛋白质降解途径，三是通过质子梯度分隔氨基酸和液泡中的离子。研究人员分别对这三个方面进行了验证，发现当V-ATPase被抑制后，液泡膜上质子梯度无法维持，非液泡氨基酸库中氨基酸含量会上升，这最终导致了细胞内铁活性的受损以及线粒体功能减弱。

氨基酸在液泡内外分布的变化是V-ATPase受到抑制后的后果之一，那么究竟是哪一种氨基酸的分布异常最终导致了线粒体功能异常呢？研究人员在氨基酸含量低的培养基上分别添加单独的氨基酸，最终发现，半胱氨酸和苏氨酸能够刺激Aft1活性到高氨基酸培养基水平。除此之外，半胱氨酸和苏氨酸同样能够拯救V-ATPase造成的线粒体呼吸异常。同时，敲除或者过表达CYS3（cystathionine gamma-lysase，胱硫醚-γ-裂解酶，降解半胱氨酸）能够增强或者降低铁调控子的活性。与之类似，敲除或者过表达GLY1（threonine aldolase，苏氨酸醛缩酶，降解苏氨酸）也能起到相同的作用。不过，从10倍氨基酸浓度合成培养基中去除苏氨酸对于V-ATPase抑制引起的铁调控子活性没有影响，而去除半胱氨酸却能组织铁调控子的激活，说明半胱氨酸在V-ATPase抑制引起的系列反应中是最重要的，而苏氨酸可能只是通过别构调控半胱氨酸代谢来起作用。研究人员通过D-苏氨酸以及L-苏氨酸的研究证实了以上猜测。

半胱氨酸含有巯基，具有氧化还原活性，它在组织中的毒性已经有许多研究。半胱氨酸在体外能产生过氧化氢，而ISCs则很容易受到氧化剂的影响，那么半胱氨酸对线粒体的影响是否是通过氧化ISCs来实现的呢？研究人员首先证实，细胞暴露在氧化剂中确实会损害铁平衡，低浓度的过氧化氢能够影响铁平衡，而V-ATPase抑制引起的内源氧化应激压力足够引起对铁平衡的影响。进一步研究显示，非液泡中半胱氨酸含量的升高是V-ATPase抑制引起的氧化应激压力产生的来源。而抗氧化基因SOD1和TSA1的过表达或者低氧条件都能抑制半胱氨酸的毒性。

最后，研究人员发现，在衰老的酵母菌中，铁调控子被激活，表明酵母菌再复制衰老过程中发生了缺铁症状。而半胱氨酸介导的铁缺乏，是衰老相关线粒体功能障碍的主要原因。

综上所述，在出芽酵母中，溶酶体样液泡和线粒体之间存在功能上的联系，液泡酸化损伤导致液泡内外氨基酸水平发生变化，尤其是半胱氨酸在液泡外的积累会通过氧化应激作用损伤ISCs，进而导致线粒体呼吸相关酶的缺乏，最终引起线粒体减少。

另外，美国洛克菲勒大学的Kıvanc¸ Birsoy同时在Molecular Cell上发表了文章Maintaining Iron Homeostasis Is the Key Role of Lysosomal Acidity for Cell Proliferation，他们通过CRISPR-Cas9系统筛选到了与溶酶体pH环境相关的两个重要功能，即胆固醇合成以及铁摄取。当溶酶体功能异常时，外源铁的补充能够拯救细胞增殖异常。最后，研究人员发现，溶酶体功能异常能够通过对铁代谢的调控影响线粒体代谢和HIF信号通路。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.035

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.01.003

参考文献

1. Friedman, J.R., and Nunnari, J. (2014). Mitochondrial form and function. Nature 505, 335–343.

2. Nunnari, J., and Suomalainen, A. (2012). Mitochondria: in sickness and in health. Cell 148, 1145–1159.

3. Hughes, A.L., and Gottschling, D.E. (2012). An early age increase in vacuolar pH limits mitochondrial function and lifespan in yeast. Nature 492, 261–265.

4. Klionsky, D.J., Herman, P.K., and Emr, S.D. (1990). The fungal vacuole: composition, function, and biogenesis. Microbiol. Rev. 54, 266–292.

5. Forgac, M. (2007). Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 917–929.

6. Dimmer, K.S., Fritz, S., Fuchs, F., Messerschmitt, M., Weinbach, N., Neupert, W., and Westermann, B. (2002). Genetic basis of mitochondrial function and morphology in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 13, 847–853.