Nature ： 警惕！大脑皮质类器官保真度尚存缺陷

来源：BioArt

撰文 | 咸姐

哺乳动物的大脑发育始于神经上皮的扩张以产生放射状胶质细胞（radial glia，RG），这些RG在脑室区的顶端表面分裂产生神经元和中间祖细胞（intermediate progenitor cell，IPC），其中IPC存在于邻近的脑室下区，而神经元则通过中间区迁移至皮层板内的特定层。与其他动物相比，人类大脑的祖细胞区域的组成要复杂的多，内纤层将脑室下区分为内外两部分，而外部的脑室下区代表了一个完全独立的祖细胞层，由IPC和一种称为外放射胶质细胞（oRG）的独特干细胞组成。这些复杂的区别使得人类在神经元输出和大脑大小上有了惊人的扩展【1】。

正是人脑发育的复杂性，使得利用模式生物研究许多脑疾病变得困难，因此体外人脑发育模型的开发成为必然趋势，而过去十多年来，类器官技术的巨大发展为此带来了新的方向。类器官模型利用发育过程中的自然自组装特性，从干细胞中产生3D培养物，以囊括内源性器官的结构和功能，因而在疾病建模、药物筛选和再生医学中有广泛应用。而基于此开发的皮质类器官，则可以很好的模拟人类大脑皮层发育的特征【1,2】。

最初的研究表明，在皮质类器官模型中保存着许多种类的细胞，但也提示了类器官细胞和原代细胞之间的某些区别，尤其是发育过程中基因表达和细胞类型成熟的时空梯度在类器官内的再现程度尚不清楚。虽然对一些最早的皮质类器官模型的分析表明了空间梯度的再现，但是目前对于皮质类器官中不同区域细胞类型的保真度和组成知之甚少，部分原因是我们缺乏对发育中的大脑皮层区域的分子细胞特征的完整而全面的说明。

2020年1月30日，来自美国加州大学的Arnold R. Kriegstein教授团队在Nature上在线发表题为“Cell stress in cortical organoids impairs molecular subtype specification”的文章，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次发现大脑皮质发育以祖细胞成熟轨迹、多种细胞亚型的出现和新生神经元的区域特异性为特征，继而发现与原代细胞相比，皮质类器官虽然包含广泛的细胞分类，但是细胞应激通路表达异常、细胞亚型分型受损，保真性存在一定缺陷，从而为评估和提高皮质类器官作为人类大脑发育模型的准确性提供了一个框架。

为了评估大脑皮层细胞类型在类器官中的保真度，研究人员对发育中的人脑皮层和皮质类器官样本进行了高通量scRNA-seq分析，并将结果与已发表的皮质类器官单细胞测序数据库进行了比较。测序结果在两类样本中均发现了与放射状胶质细胞（RG）、中间祖细胞（IPC）、成熟神经元和中间神经元相关的广泛细胞类型。但是，与原代细胞样本相比，类器官细胞中表达HOPX（外放射胶质细胞的标记物）的细胞数量减少了45%，而EOMES阳性的IPC的细胞数量也减少了63%，同时，SATB2阳性的上层神经元数量更是减少了94%。分析结果表明，虽然皮质类器官保留了大部分神经类型和细胞增殖状态，但是细胞类型和亚型与所有类器官来源的细胞的相关性均明显变差，皮质类器官中细胞类型保真度受损，并且不同的培养方式都能得出相似的结果（图1）。

图1原代细胞和皮质类器官细胞亚型的分子比较

从RG细胞产生神经元的分化程序是高度保守的，本文的研究人员试图找出区分IPC和神经元的基因。他们惊讶地发现，原始细胞的类型是由两倍于皮质类器官细胞的基因所决定的，而这些基因在数据集之间基本上没有重叠。通过绘制原始样本中区分神经元和RG细胞的每个基因的标准化计数发现，在神经元中RG细胞标记物的表达较低，而RG细胞中几乎不表达神经元标记物。但是，这些细胞在皮质类器官细胞中却有大量的共表达，导致类器官细胞和原代细胞类型及亚型之间的对应性降低。

与此同时，研究人员还发现，大脑发育事件的进展，如神经元和胶质细胞类型的产生，在类器官中比在原代组织中发生得更快，而祖细胞和神经元区域不像在体内那样得到广泛地扩展。经过分析转录组数据发现，这是因为那些本来存在于体内的分子成熟过程在皮质类器官中并没有被激活，这些程序在类器官中的失调可能影响它们完全再现体内皮质神经元分化轨迹的能力。此外，研究人员利用单细胞测序数据建立了一种新的大脑皮层区域特征分类模式，并且发现这些皮层区域的分子特征均出现在类器官神经元中，但是它们并不在空间上相互分离。

进一步的，为了探索类器官RG细胞是如何再现其原代细胞亚型的，研究人员对oRG细胞进行转录组水平分析比较，结果发现，许多基因在皮质类器官oRG细胞中的表达高于原代oRG细胞，而这些基因在很大程度上与糖酵解或内质网应激相关，但是，在人类正常皮质发育过程中，这些基因几乎没有表达。随后深入实验证实，类器官的细胞培养环境是其细胞应激增加的主要原因，而应激的增加则损害了皮质类器官的细胞亚型特异性。而把皮质类器官移植到小鼠大脑皮质后，体内环境的存在使这种细胞应激减弱，细胞亚型特异性缺陷缓解。

综上所述，本文提供了关于人类大脑皮层细胞发育及它们在大脑类器官模型中所能保存的全面的分子特征。利用单细胞转录组测序，确定了大脑发育的广泛的细胞类别和类型，以及更细化的细胞亚型，同时发现，与原代组织相比，类器官含有较少数量的细胞亚型，它们的细胞常常共同表达多种标记基因，从而导致广泛的类型分配，而这也与皮质类器官中应激通路的激活密切相关。本文的发现，为更好地理解正常的人类大脑发育和对体外类器官模型的保真度进行基准测试提供了宝贵的资源，同时也提示我们，在研究发育过程、细胞类型特异性疾病表型或细胞连接时，必须仔细考虑类器官保真度的缺陷问题。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-1962-0

参考文献

1. Lancaster,M. A. et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.Nature 501, 373–379 (2013).

2. Kadoshima,T. et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, andspecies-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc.Natl Acad. Sci. USA 110, 20284–20289 (2013).