Cas9和纳米孔测序结合的新型目标区域测序技术—nCATS

来源：BioWorld

原标题：Nat Biotech：Cas9和纳米孔测序结合的新型目标区域测序技术—nCATS

自从1977年，Sanger发明第一代测序技术-链终止法以来，测序技术便成为人们获得DNA遗传信息，揭示生命奥秘，发现遗传疾病规律的最有力手段之一。

随着基因组时代的到来和人们越来越高的基因序列信息的需求，测序技术得以快速发展。虽然，目前二代的高通量测序仍是在基因组测序和转录组测序中应用最广泛的技术手段，但其存在读长短、成本高、依赖PCR扩增等缺陷。

近年来，不需要PCR扩增便可以用来读取长片段的第三代测序技术-单分子实时测序技术发展越来越快，并在基因组组装，甲基化鉴定和基因组结构变化等方面得以广泛应用。目标区域测序技术（targeted sequence）则是通过富集人们关注的基因片段，实现在减少测序成本和人力成本的同时，获得目标基因片段的高深度覆盖。

为了结合两者的优点，研究者们尝试开发出适合长片段读长的目标区域测序技术（targeted sequence），从而能够更好的服务于科研和临床。然而，目前适合三代测序的目标区域测序技术-PCR扩增和CATCH-seq技术,都存在依赖PCR扩增，丢失基因组修饰信息等缺点。

2020年2月10日，来自美国约翰·霍普金斯大学（Johns Hopkins）大学的Winston Timp团队在Nature Biotechnology 发表了最新研究成果：Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation。

本研究详细介绍了其团队利用Cas9和纳米孔测序接头连接（adapter ligation）开发出的适合第三代纳米孔测序的纳米孔Cas9目标区域测序技术(nanopore cas9-targeted sequence, nCATS)。

Winston Timp 团队研究人员首先介绍了纳米孔Cas9目标区域测序技术（nCATS）富集目标基因DNA片段测序的流程及原理：首先通过碱性磷酸酶（CIP）去除基因组DNA末端原有的磷酸基团，然后，通过Cas9/gRNA复合物（RNP）在目标区域的两端切割产生含有磷酸基团的新DNA末端，加入Tap酶和dATP从而将dATP连接到新的含有磷酸基团的目标DNA片段的末端，随后连接上适合纳米孔测序的接头，上机测序（图1A）。

为了验证此项技术的效果，研究人员在基因组上选用了10个已知的12k到24k长度不等的片段作为目标靶向区域。在这10个目标片段中，3个片段包含了癌基因（TP53,KRAS和BRAF）用来测试cCATS在检测基因突变方面的效果，5个片段包含甲基化修饰位点的基因（KRT19,SLC12A4,GSTP1,TPM2和GPX1）用来测试其检测基因修饰方面的能力和2个Winston Timp团队原来鉴定出的包含6k到8k缺失的片段用来评价nCATS在检测基因组结构方面的功能。研究人员开发的初级纳米孔Cas9目标区域测序技术（nCATS）中，在目标区域的两端各只选取了一个sgRNA。

在研究人员的选用的四个癌细胞系中，初级的nCATS利用纳米孔MinION平台在测试的片段中便能够取得18x到864x的覆盖深度。即使利用通量小的纳米孔Flongle平台，也能够达到8x到65x的覆盖深度。为了能够提高nCATS的特异性减少脱靶片段引起的测序浪费，研究人员在目标区域的两端各选用了多个sgRNA，开发出了增强版的nCATS技术。增强版的nCATS在所有的测试片段中，结合MinION平台的平均覆盖深度高达680x，结合Flongle平台的平均覆盖深度也达到34x（图1b）。随后，研究人员将nCATS应用到组织样品的研究，在乳腺癌组织/正常组织样品中也取得93x/70x的覆盖深度（图1C）。

图1

随后，研究人员测试和优化nCATS在检测核苷酸多态（SNP）方面的效果，通过比较不同测序深度，不同突变分析（SNP calling）方法，最终利用纳米孔突变分析（nanopolish variant calling）结合双链测序结果能够发现GM12878癌细胞TP53位点的17个已知突变，而没有一个假阳性。最后，研究人员测试nCAS不同的癌细胞系中分析基因组甲基化修饰和基因组结构-片段缺失方面的灵敏度。在本研究测试的位点中，nCAS在这两方面都能有出色的表现。

总之，这项研究开发的纳米孔Cas9目标区域测序（nCATS）利用Cas9技术和第三代测序技术-纳米孔测序技术读长片段长的优点，实现细胞和组织的低成本，低基因组起始量检测目标DNA的突变，目标DNA区域的修饰和目标基因组结构的改变。nCATS技术必将在科研和临床检测中发挥积极作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0407-5