NSMB ：夏荻团队揭示完整折叠蛋白的跨膜运输机制

来源：BioArt

撰文 | 詹景瑜

线粒体作为细胞的能量工厂，通过其内膜上的五个呼吸链复合物（I, II, III，IV和V）把细胞内的养分转化成化学能（ATP）。作为呼吸链重要组成部分，复合物III是由22个蛋白亚基组成，其中铁硫蛋白（ISP）是复合物III的一个非常重要的功能亚基。这些蛋白亚基是如何按顺序组装起来是一个重要的研究课题，任何在装配过程中引入的错误会导致致命的疾病。然而这方面的研究相当匮乏。

2020年2月10日，美国国家癌症研究所（NCI）夏荻实验室在Nature Structural & Molecular Biology杂志上发表文章Structures of AAA protein translocase Bcs1 suggest translocation mechanism of a folded protein，发现了Bcs1蛋白将铁硫蛋白运输通过线粒体内膜的机制，这对于作为细胞能量工厂的线粒体的生成极为重要。铁硫蛋白是线粒体内膜上复合物III的重要主成部分，与细胞呼吸链复合物I，II，IV及V一起通过氧化还原反应将细胞内的养分转化成生物体所需的ATP和能量。这项研究帮助揭示了细胞呼吸链复合物III的组装过程，并精确定位Bcs1蛋白上许多导致严重遗传疾病的突变点。

完美折叠整合的铁硫蛋白包含三个部分：N-端域留在线粒体基质里， C-端的功能域则在线粒体膜间隙（内外膜之间的狭小空间），以及连接这两端的一个跨膜螺旋区横跨线粒体内膜。不同于其他很多蛋白，铁硫蛋白含有一个重要的铁硫基团（2Fe2S），而这样的铁硫基团只能在线粒体中合成。所以铁硫蛋白最先在细胞质中合成时是不含铁硫基团的，并以展开线状的形式被输送到线粒体基质中并在那里它的C-端功能域重新折叠和加装铁硫基团。那么这个C-端功能域是如何再次跨过线粒体内膜并最终到达线粒体膜间隙的呢？并且在被运输通过线粒体内膜的过程中不被解构。到目前为止，还没有研究描述过输送这样一个直径约25Å的完整蛋白域跨过真核生物膜的机制。值得指出的是通常蛋白质跨膜转送的形式是将蛋白解链线性输送。更重要的是这样的机制还不能破坏或影响跨膜的质子动力势（proton motive force, PMF）。质子动力势对ATP合成及一系列细胞功能至关重要。

能实现这个任务的是一个叫Bcs1的蛋白， 属于AAA 蛋白家族 (ATPase associated with various cellular activities) 。序列分析揭示Bcs1蛋白由三个功能域组成：N-端的单螺旋跨膜区，中间的Bcs1-特有域（Bcs1 specific domain）， 以及C-端的AAA结构域。

NCI的资深研究员（senior  investigator）夏荻指出：“长久以来，生物学家知道铁硫蛋白需要先经过折叠成熟后再被跨膜运输，但对这个转运的过程和机理知之甚少。通过研究同源的小鼠Bcs1蛋白（mBcs1,与人的BCS1L蛋白序列相似度为94%）我们发现小鼠Bcs1蛋白更适合于结构与功能方面的研究。这是我们成功关键。这也是相关机理第一次被发现阐明。” 利用冷冻电镜和X射线晶体学，夏荻研究组解析了Bcs1蛋白在三种不同状态下的高分辨率结构，从而为解释铁硫蛋白的运输过程提供了重要的实验依据。1）不同于常见的AAA蛋白形成的六聚体狭窄转运通道，Bcs1蛋白用七个单体来形成一个桶状通道，这可能为容纳并运输折叠铁硫蛋白提供了空间。2）在没有核苷酸结合的初始状态下（apo mBcs1），Bcs1转运通道的平均直径为40Å，容积达到28，000Å3，足以容纳铁硫蛋白。因此铁硫蛋白可能在此状态下进入通道。3）当Bcs1的AAA结构域与ATP结合时（ATP-bound mBcs1），所有的Bcs1单体发生构象变化，表现在其通道直径变为20Å，容积收缩为初始状态的30%，从而将铁硫蛋白的C-端功能域（head domain）挤出通道，仅剩其跨膜螺旋区还留在通道内。与此同时转运通道入口的直径也从40Å缩小到20Å，确保底物不会从转运通道入口退出。4）最后ATP水解成ADP，Bcs1将铁硫蛋白运输释放到线粒体内膜上复合物III处，同时回到初始构象，也就是与ADP结合时的构象（ADP-bound mBcs1）。

计算机模拟Bcs1膜蛋白结构构象变化：从apo到ATP再到ADP。伴随着蛋白的构象变化，Bcs1的内部容积被压缩从而实现将ISP蛋白底物跨膜输送。

Bcs1结构的解析及分析让夏荻的研究团队进一步发现Bcs1蛋白上不同位置的突变与两种遗传性疾病有关：GRACILE综合症和Bjornstead综合症。突变的Bcs1无法将铁硫蛋白组装到呼吸链复合物III上，造成呼吸链复合物III缺乏，细胞呼吸过程受阻。然而突变发生在Bcs1蛋白的不同位置时，疾病的表现和预后也不尽相同。当Bcs1特有的结构域（Bcs1 specific domain）发生突变时，不仅呼吸链复合物III无法组装形成，且质子动力势（proton motive force）也受影响，患儿会出现肝脏和肾脏衰竭进而早夭，即GRACILE综合症。当突变发生在Bcs1的AAA 结构域时，仅有呼吸链复合物III的组装受影响，表现为患儿听力受损，但是整体症状相对较轻对病人寿命影响不大，即Bjornstead综合症。具体的Bcs1突变造成的疾病的临床症状因人而异，可能会落在这两个极端表现之间。

这项研究成果有着巨大的应用前景。比如，可以以此为靶点研发新的抗细菌和真菌的药物，这尤其对农业生产有帮助，因为复合物III是已知的抗菌抗虫的重要靶点。夏荻研究员也期待着有朝一日，这项研究成果可以用于新的抗癌药物的研发。“沿着这条路，我们也许可以针对癌细胞的呼吸链来治疗癌症，尽管仅仅这一项措施可能并不足够：癌症细胞可以通过其它通道比如糖酵解过程把葡萄糖转化成能量，从而绕过呼吸链。但是新的研究表明，癌症治疗可以同时针对性地抑制这两条产生能量的通路，从而有效的杀死癌症细胞。但是在把这项研究成果转化应用于癌症治疗前，还有许多工作要做。”

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41594-020-0373-0