刘建钊、贾桂芳团队分别开发新的m6A高通量测序方法

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近年来RNA化学修饰研究引起了学术界的密切关注。在迄今为止已经鉴定的150多种RNA化学修饰中，m6A（N6-甲基腺嘌呤）修饰是哺乳动物细胞信使RNA (mRNA)内部丰度最高的碱基化学修饰 (3-5 m6A/mRNA)，其生物学功能研究也最为广泛，近乎影响RNA代谢寿命过程中的每一个环节，包括转录、剪接、降解、翻译和运输等。这些研究成果的取得都得益于m6A检测和测序技术的发展，其中2012年发表的基于m6A抗体免疫沉淀的高通量测序技术(m6A-seq【1】或称MeRIP-seq【2】)最为常用，但该方法只能提供100-200核苷酸的检测窗口。

为了深入理解m6A甲基化的功能，单碱基分辨率信息是必需的，它能在碱基层次上帮助我们理解细胞内甲基化的机理和功能。领域内先后探索了一些RNA m6A单碱基或近乎单碱基分辨率的测序方法，包括基于抗体/RNA光交联的方法（PA-m6A-seq、miCLIP等）、基于RNA m6A甲基化敏感的内切酶法 （m6A-REF-seq或称MAZTER-seq）、基于m6A结合蛋白融合碱基编辑蛋白的方法（DART-seq），这些方法都促进了领域的发展，但多数都是间接的手段（除m6A-REF-seq外）。基本原理是通过抗体-RNA光交联位点的碱基逆转录突变信息或者特异性蛋白-RNA结合区域附近碱基的编辑信息，来判断突变点或编辑点近邻的腺嘌呤为m6A，这往往会在真实位点鉴定（尤其是簇位点）上产生偏差。m6A-REF-seq方法是一个好的直接方法，但是当前的内切酶只对m6ACA序列响应，还有大部分其它甲基化基序序列未被测出。因此，该领域还需要发展新的m6A单碱基分辨率测序方法，解决当前存在的问题。

2020年4月27日，浙江大学高分子科学与工程学系刘建钊课题组在Nature Chemical Biology上长文发表题为A metabolic labeling method detects m6A transcriptome-wide at single base resolution的研究，报道了一种称为m6A-label-seq的高通量测序方法，通过细胞自身代谢对全转录组RNA m6A位点进行标记，标记位点可发生化学处理诱导的逆转录碱基突变，进而实现单碱基分辨率测定。

细胞内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基转移酶的辅助因子，可在mRNA m6A甲基转移酶(METTL3/METTL14)的作用下，将其甲基转移到mRNA上的特定腺嘌呤的N6位点形成m6A。SAM是以甲硫氨酸和三磷酸腺苷（ATP）为原料，在甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的催化下合成的。作者从甲基化源头考虑，引入带有烯丙基修饰的甲硫氨酸，在细胞内MAT作用下生成烯丙基取代的辅助因子allyl-SAM或者硒代同源物allyl-SeAM (图1)。细胞内METTL3/METTL14利用allyl-SAM或allyl-SeAM，将其烯丙基修饰到mRNA上原本是m6A的位点，得到a6A（N6-烯丙基腺嘌呤），a6A在温和的碘加成条件下诱导生成环化1,6位环化腺嘌呤(cyc-A) (图1)，然后，RNA cyc-A在逆转录成互补DNA（cDNA）时发生碱基错配【3】。最后，借助高通量测序和生物信息学分析突变位点，得到了全转录组m6A位点的单碱基分辨率图谱。

图1. 示意图描述利用代谢标记测定RNA m6A精确位置的方法

作者利用m6A-label-seq方法对人体HeLa和HEK293T细胞系以及老鼠H2.35细胞系的mRNA m6A位点、位点距离、m6A共有基序(m6A motif)等信息进行了系统分析。为了验证该高通量测序方法的准确性，作者选取了个体基因进行了低通量的测序验证。作者同时也将m6A-label-seq与miCLIP-seq、m6A-REF-seq、DART-seq等已知测序数据进行了对比，选取了16个特征位点，用独立正交的SELECT【4】 m6A鉴定方法验证了这些位点的可靠性。

综上，该研究的测序方法特点如下：（1）利用代谢对甲基化位点的源头标记并直接单碱基分辨率测定，相对于当前的间接方法有更高的准确率；（2）适用于细胞内RNA多种不同甲基化序列(m6A motif)的鉴定；（3）对测定m6A簇修饰有优势。该方法为将来研究细胞核内种类繁多的新生RNA的m6A甲基化位点及状态演变提供了重要工具。另外，该方法在标记产率和标记时间窗口尺度方面还需要优化提高，为研究更多的细胞事件过程提供便利。

浙江大学高分子科学与工程学2017级直博生舒潇与2016级直博生曹婕同学为本论文的共同第一作者，刘建钊研究员为通讯作者。通讯作者也是浙江大学生命科学研究院兼职PI。

在同期杂志，北京大学贾桂芳课题组发表了“Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N6-methyladenosin”的研究论文。

该方法巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作为催化剂，将mRNA上化学惰性的m6A转化为高反应活性的中间态产物N6-羟甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫苏糖醇（DTT）的巯基与hm6A发生亚胺1,2加成反应，将不稳定的hm6A转化为更稳定的巯基加成产物dm6A。dm6A上的自由巯基可以与甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反应，实现在mRNA上m6A的位置标记生物素Biotin，最终可被链霉亲和素珠捕获，从而富集含有m6A修饰的RNA片段供后续高通量测序使用。此方法被命名为m6A-SEAL（FTO-assisted m6A selective chemical labeling method）。

在人HEK293T细胞的polyA+ RNA上应用m6A-SEAL之后，研究者们鉴定到了8605个高置信度的m6A位点，这些位点符合m6A的保守序列（RRACH）和分布模式。早期利用m6A抗体测序技术在不同的植物中鉴定出了非经典的m6A保守基序（UGUA），但难以判断该结果是否来自抗体非特异性富集信号。研究者们在水稻中应用m6A-SEAL也鉴定到了UGUA的非经典基序，并验证了其真实性。最后通过该研究组之前开发的基于qPCR的m6A单位点检测方法SELECT验证了多个m6A位点，证明m6A-SEAL作为化学共价交联技术，要比基于抗体的方法或DART-seq具有更高的可靠性和灵敏度。

此外，除m6A外，FTO还对RNA5’帽位置的N6,2'-O-二甲基腺嘌呤 (cap m6Am）具有催化活性，能将其催化为hm6Am。为了验证m6A-SEAL测序方法是否还会同时检测cap m6Am，研究者们通过体外酶活性实验和标记实验发现目前m6A-SEAL方法中使用的FTO氧化反应条件只能特异性将m6A反应成hm6A，通过优化FTO氧化反应条件可以实现m6A-SEAL只针对cap m6Am的标记和测序。

总之，该项研究首次利用FTO酶辅助实现了m6A化学标记，并成功应用于高通量测序。m6A-SEAL具有高灵敏度和高特异性的特点，可以应用于少量mRNA样品中。未来研究者们将继续对m6A-SEAL进行优化和改造，以实现单碱基分辨率。由于FTO可以氧化催化RNA的cap m6Am和DNA的N6-甲基脱氧腺嘌呤（6mA），未来m6A-SEAL通过优化有望应用于这些化学修饰的测序。同时该方法除了可以在m6A上标记biotin用于富集，还可以标记荧光素，未来用于m6A的成像。

北京大学贾桂芳实验室已毕业的博士研究生王烨为论文的第一作者，已毕业的博士研究生肖雨、博士后喻琼和本科生董舜卿为共同作者，贾桂芳研究员为通讯作者。