基于改良RT-RPA实现对新冠病毒RNA的双基因同时检测及单拷贝灵敏度的现场检测

来源：X一MOL资讯

从2019年底新冠肺炎爆发到现在已经在全球范围内造成了超过580万人的感染（截止2020年5月28日）。目前全球新冠疫情还非常严峻，由于新冠病毒已经被证明能够在人与人之间交叉传播，为了尽可能地减少交叉传染，发展现场的乃至居家的新冠病毒检测手段很有必要。近日，哈尔滨工业大学生命科学中心陈西团队在新冠病毒抗疫课题研究中取得突破性成果，通过改良RT-RPA（reverse transcription-recombinase polymerase amplification）法实现了对新冠病毒RNA的双基因同时检测及单拷贝灵敏度的现场核酸检测。

新冠病毒SARS-CoV-2（2019-nCoV）是一种RNA病毒，经典的检测RNA病毒的手段是逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。然而RT-PCR需要使用昂贵的实时荧光定量PCR仪器，同时需要专业人士操作，尚不是一种现场检测技术。而基于抗体的现场检测手段，特异性和灵敏度一般不及核酸检测方法，同时发展出高效价的抗体也需要数周乃至数月的时间，难以实现应急检测。在本研究工作中，利用改良的RT-RPA法，即逆转录-聚合酶指数扩增（RT-ERA，reverse transcription-enzymatic recombinase amplification）技术，实现了对新冠病毒RNA的全程闭管、三十分钟无需热循环、可现场可居家的超灵敏度快速检测，不仅能对新冠病毒进行检测，其检测方案也可以适用于以后可能爆发的其它RNA病毒。该检测技术的第一步是将病毒RNA片段逆转录为cDNA以便于后续核酸扩增；接下来用ERA恒温扩增的方式，搭配合适探针，进而实现对cDNA的指数扩增以及对扩增后的核酸产物的检测。检测结果既可以通过观察荧光，也可以用更为简便的试纸条方式呈现出来。

本研究工作中，用exo荧光探针及引物可实现对新冠病毒基因单拷贝灵敏度的荧光检测。利用检测N基因的exo探针及引物搭配检测S基因的exo探针及引物使用实时荧光定量PCR仪，可以实现对N基因和S基因的同锅（one-pot）同时检测。利用nfo亲和探针及引物搭配胶体金试纸条可以更方便地实现现场检测。整个检测设备可以简化为一个家用的保温杯。将保温杯中注入温水（~40度），把含有核酸样本的反应管在温水中温热30min后，用试纸条检测结果，从而实现了居家的病毒核酸检测。

本研究工作有几大特色。其一是引入了WEPEAR流程的全程闭管检测方案（whole-course encapsulated procedure for exponential amplification from RNA）。从加入RNA，到逆转录为cDNA，再到cDNA扩增，最后得到检测结果全程不开盖，使检测结果更为可靠。第二个特色是能够同时检测两个基因，例如同时检测新冠病毒的N基因和S基因，双基因检测结果互相印证，提高了检测结果的可靠性进而也降低了检测结果假阳性及假阴性的概率。第三个特色是实现了单拷贝灵敏度的检测，即便样本中仅含单个RNA核酸分子也能够被可靠地检测出来，这代表着目前已经报道的对新冠病毒检测的最高灵敏度之一（绝对量：单拷贝，即一个分子；浓度：0.05拷贝/µl），这种超高的检测灵敏度有利于避免假阴性结果的发生，同时也可以检测出早期感染的对象。第四个特色是咽拭子样本可以不通过样品处理，能直接用于检测。第五个特色是检测方案能够在一周之内开发出来，满足应急检测需求，同时也可以应对未来的相关RNA病毒的爆发。第六个特色也是最重要的特征是实现了现场乃至居家检测，通过简单的蓝白光成像仪乃至蓝光手电筒可以通过荧光进行便捷检测；通过胶体金试纸条的方式可以实现更为简便的居家检测，无需特殊设备。

这一成果近期刊登在Cell Discovery杂志上，以correspondence（致编辑的信）的形式在线发表。文章的第一作者是科研助理夏思敏，陈西研究员为本文的通讯作者，相关研究工作已经申报发明专利。