Science | 转录聚合酶催化的新型RNA复制子

来源：BioArt

转录聚合酶（即DNA依赖的RNA聚合酶）介导从DNA向RNA的信息传递，催化从DNA模版转录合成RNA。除此之外，体外试验显示大肠杆菌和T7噬菌体的转录聚合酶可以指数复制某些RNA模版。这种RNA复制是指对RNA模版的全长复制，然后将得到的RNA副本作为模版用来指导新的全长RNA的合成，这种RNA复制过程不涉及DNA。
T7噬菌体的转录聚合酶（T7 RNAP）不仅可用来研究DNA依赖性RNA聚合酶活性，而且可作为研究转录聚合酶介导RNA复制的模型酶。目前已经鉴定出5种可被T7 RNAP进行RNA复制的RNA序列，所有的都能形成长发夹状的二级结构【1】，但这些可被复制RNAs的来源尚不清楚。Konarska和Sharp推测RNA复制模版可能是T7 RNAP制备过程中预先存在的RNA污染物【2】，而Biebricher和Luce认为RNA复制模版是T7 RNAP反应中分子进化的结果【3】。对于RNA复制仍然存在诸多问题：依赖于DNA的RNA聚合酶如何复制RNA？转录聚合酶可以复制的RNAs家族其多样性如何？转录聚合酶复制RNAs的起源是什么？
近日，来自斯坦福大学医学院的Andrew Z. Fire在Science杂志发表文章，Transcription polymerase–catalyzed emergence of novel RNA replicons，报道了利用T7噬菌体的转录聚合酶构建了体外RNA复制体系，鉴定出数百个新型可复制RNA，并定义了RNA复制的3个机制特征——亚终末从头起始、RNA形状改变和间断性滚环式合成，并揭示出DNA是新型RNA复制子的起源。

研究人员首先对经典的T7 RNAP反应体系进行改动，加入高浓度（2uM）的T7 RNAP，且不加入核酸模版。37℃孵育24 h后，平行的反应体系中产生大量合成的RNA，每个反应中存在不同的RNA，结果与Biebricher和Luce的发现一致。对合成产物进行RNA-seq，发现每个反应产生一簇（cluster）或多簇RNA序列（命名为RNA簇，RNA species），而每个RNA簇都是一个序列密切相关的异质群体。24个测序反应中都有少量RNA簇占优势的现象，且优势的RNA簇的参考序列彼此不同。大多数RNA簇的参考序列长度在60-80核苷酸，而链的方向既有与参考序列相同的，也有互补的。虽然RNA簇的序列内容各异，但具有共享的结构特征：一种“双向重复（2-way repeat）”结构，即在整个RNA长度上有一个反向重复，可能形成一个长的发夹状结构；一种“四向重复（4-way repeat）”结构，即在双向重复的每一臂上嵌入一个较短的反向重复。突变实验显示双向重复和四向重复结构对于T7 RNAP介导的高效率RNA复制过程是必需的，即RNA复制模版需要有长的发夹状结构以及改变二级结构的能力（形状改变，shape-shift）。
无核酸模版的T7 RNAP反应体系产生的RNA簇是否可以用作模版指导RNA合成？将RNA物质稀释后加入新鲜的T7 RNAP反应体系，发现模版依赖的RNA合成过程可以发生。为了进一步排除体系中其他产物的影响，研究人员使用化学合成RNA作为模版。Konarska和Sharp将RNA复制的互补链称为G链（5’和3’端各有2个G）和C链（5’和3’端各有2个C）。研究人员编号为12.1的RNA簇进行化学合成，并命名为Y2 RNA（12.1序列类似于T7 RNAP进行RNA复制的Y RNA）。合成的Y2 RNA G链和C链单独或混合均不能有效指导RNA合成，在Y2 RNA的G链和C链的3’端添加额外的核苷酸后，T7 RNAP反应产物的量显著增加。对比化学合成模版和无模版反应产物，发现无模版反应产物具有3’端序列的多样性，而化学合成模版反应产物具有特定的3’端核苷酸添加。此外，以合成的G链为初始模版时，起初能观察到互补C链产物的合成，随后以互补C链为模版指导合成G链产物，且新合成的G链产物具有多样化的3’核苷酸添加，表明RNA复制周期涉及到两条链。即T7 RNAP完成5’到3’的复制后，会在3’添加核苷酸使RNA产物更适宜用作模版使用。

RNA多连体（RNA concatemers），即RNA链中包含多个重复的全长模版序列，出现在T7 RNAP反应产物中。探究T7 RNAP反应体系中RNA二聚体（RNA dimer，两个重复）出现的机制，可能有两种：单模版和双模版。单模版机制中，同样的单体模版分子指导合成两次形成二聚体；双模版机制中，2个不同的单体模版分子（其序列可能相同）指导二聚体的各一半。为了阐明RNA二聚体形成的机制，研究人员对单体模版库的6个位置进行随机碱基置换，然后进行T7 RNAP反应。结果显示，大部分二聚体的2份重复在指定6个位置上的序列具有高度的一致性，表明单模版是RNA二聚体形成的主要机制。那么T7 RNAP如何使用同样的模版分子持续地指导多轮RNA合成？RNA合成中，当T7 RNAP到达RNA模版的5’端时，能够从模版的5’端跳到3’端而不从模版-产物复合物上解离，然后继续进行RNA合成，即间断性滚环式合成（interrupted rolling circle synthesis）。

无核酸模版的T7 RNAP反应体系中进行复制的RNA来源是什么？研究人员利用微液流技术进行高通量无模版反应，发现产生了大量的RNA簇，其具有不同的序列，但结构类似。通过序列比对分析，显示复制的RNAs可能是从高浓度T7 RNAP反应体系中残留的核酸中进化出来的，即复制的RNA可能起源于DNA的指导下。对比没有DNA、DNA、DNase处理过的DNA、热碱处理的DNA（水解掉残留的RNA，且变性DNA）四种条件下T7 RNAP的反应结果，只有DNA和热碱处理的DNA两组产生了复制的RNA，而且DNA的序列与复制RNA有匹配，且能从复制RNA的任一端开始并扩展到第二个四向重复单元。
总之，复制RNA的形成过程是：1）将DNA转录成RNA；2）进行一轮的自模版3’端扩展获得四向重复单元；3）进行一轮的自模版3’端扩展获得完整的双向重复和四向重复单元。具有双向重复和四向重复的RNA通过达尔文式选择迅速成为模版，进行RNA复制反应。
-总结-
研究鉴定了数百种转录聚合酶催化的新型RNA复制子，并对RNA复制进行深入探究，揭示出长发夹状二级结构对RNA复制的重要性、RNA复制的特征及复制的RNA起源于DNA。为自然产生的RNA遗传元素的起源和复制提供了模型，并提出了细胞环境中RNA作为遗传物质的传播方法，为我们理解RNA遗传提供了新的视角。
原文链接：https://science.sciencemag.org/content/early/2020/03/25/science.aay0688/tab-pdf