神经递质释放位点的“决策树”

来源：BioArt

突触传递（synaptic transmission）是神经元之间最基本的信息交流方式。它的核心功能是将电信号（动作电位）转换成化学信号（神经递质）并作用于下一级神经元。神经递质本身对于神经系统是相当危险的，所以它的合成、存储、回收和降解都受到严格调控。在突触末梢，神经递质以极高的浓度（100-1000 mM）封装在直径约 40 nm的小液滴中称之为囊泡(vesicle)。囊泡的表面由脂质双分子层构成，而递质释放的本质也就是囊泡与突触前膜融合的过程。当动作电位到达突触末梢时，胞外的钙离子通过神经末梢的钙通道进入突触，触发囊泡融合，整个过程在数十至数百微秒内完成。那么矛盾的地方来了：钙离子进入突触后只能进行热运动，而由于生物的体温普遍较低 (仅高于冰点几十度)，钙离子扩散缓慢，短时间内只能波及极其有限的空间，那神经末梢又是如何在瞬间感知到钙信号的？

为保障响应速度，神经元进化出了一套十分精巧的系统。它的原理非常简单：时间 = 距离/速度，既然速度受物理定律的限制，那就干脆压缩空间距离。突触末梢的秘密武器是一套称之为活跃区（active zone）的分子机器, 它实际上是围绕着钙通道的一个巨型蛋白复合物，能够捕获囊泡并使其向钙通道靠近（10-50 nm）。这样一旦钙通道启动，内流的钙离子将在极短距离内发现囊泡并触发递质释放。活跃区的角色非常像“红娘”， 她一手牵着钙通道，另一手牵着囊泡，创造机会使二者融合（递质释放）。于是这个过程中就有一个角色定位的问题：活跃区到底是围绕钙通道脱单产生的附属品？还是更像一个核心社交平台，吸引钙通道和囊泡在线交流？
2020年6月16日，哈佛医学院的Pascal S. Kaeser研究团队在Neuron杂志上发表文章Synapse and Active Zone Assembly in the Absence of Presynaptic Ca2+ Channels and Ca2+ Entry，对这一问题做出了回答：活跃区更像是社交平台，它决定了突触联系的位置和功能特性，而钙通道只不过是该平台的VIP用户。

这种角色辨析对于回答神经元如何决定递质释放位置有着重要意义。对于这个问题目前有两种主流假说：一种认为释放位点的生成是钙信号介导的主动过程，即钙离子通道在动作电位的反复驱动下产生局部高浓度钙信号，启动信号通路，招募活跃区蛋白，通过活跃区捕获囊泡形成释放位置；另一种假说则认为释放位点是活跃区核心蛋白（如RIM, ELKS, Munc13等）之间通过液-液相分离（phase separation）随机生成的有序组装。一旦组装完成，释放位置即被定义。

为验证第一种假说，研究人员决定从去除钙信号入手，切断其核心信号通路。但这种操作有两重风险：1）钙通道和钙信号对于生物体必不可少，贸然干预往往导致死亡；2）钙通道是多种亚基的随机组合，种类繁多且功能相互代偿，这对基因操作提出了重大挑战。为应对以上风险，研究人员采用体外培养神经网络的方法进行功能测试，这避免了动物因器官衰竭而死亡的风险。而另一方面，为避免产生代偿效应，他们同时敲除了所有能够进入轴突的钙通道。当这些操作完成以后，他们惊奇地发现：虽然突触传递完全停止，但突触密度，微观结构，囊泡分布以及活跃区无论从哪个角度观察都完好无损。为进一步验证结果，研究团队利用病毒在小鼠脑内对听觉系统的一类巨突触（Calyx of Held）进行了同样的操作（由于只针对特定环路进行局部操作，动物存活），实验结果与之前完全一致。该结果直接推翻了第一种假说，说明释放位点的生成并不依赖钙通道或钙信号。
为验证第二种假说，即活跃区是否具有决定释放位置的能力。研究人员首先令神经元在上述环境中发育生成活跃区。随后，为测试这些 “看上去很美” 的活跃区是否具有应有的功能，研究人员利用病毒重新表达了钙通道。结果发现突触传递立即恢复。这说明这些活跃区拥有自组装，招募钙通道和囊泡，感受钙信号和介导递质释放的一切功能。经过该实验，研究人员认为活跃区的自组装定义了递质释放位置，组装结束后，活跃区蛋白招募相关功能元件（钙通道和囊泡）介导递质释放。
一个有趣的问题是：在钙通道的诸多亚型中，只有少部分能够在轴突中富集，如果钙通道完全由突触活跃区进行招募，这是否意味着轴突对于钙通道的选择性来源于活跃区？为验证这种假设，研究人员对钙通道进行了一系列改造，逐步敲除了钙通道与活跃区蛋白的相互作用位点。实验结果表明：钙通道进入轴突末梢的丰度与这些作用位点高度相关。由于这些位点都处在钙通道α亚基的C末端，研究人员认为钙通道的C末端的氨基酸序列很可能存在钙通道的定位信号。
该研究明确了活跃区和钙通道在递质释放位点决策中的角色定位，有力证明了活跃区的产生是钙通道富集的前提，并在此基础上鉴定了钙通道的定位序列。突触传递是一切神经编码的基础，而钙通道和活跃区又控制着突触传递的基本性质，在神经计算中具有举足轻重的作用。对于该系统的深入了解无疑将为神经科学的长足发展提供有力的理论支持。
该项研究由哈佛医学院Pascal Kaeser 团队完成。Richard Held （现斯坦福大学），刘长亮（哈佛医学院），马锟鹏（哈佛医学院&中国科学院）为该研究的共同一作。

图1：递质释放位点由突触前活跃区（蓝色区域）决定，活跃区自组装完成后与突触后受体偶联（trans-synaptic nanocolumn）定义递质释放的空间位置，之后活跃区招募钙通道与囊泡形成有功能的释放位