基因编辑进入新时代

来源：BioArt

撰文 | Leon

责编 | 雪月

CRISPR的发展重新振兴了基因编辑领域。现在，新一代CRISPR技术已经可以更有效、更精确地修改基因组（BioArt：『珍藏版』Nat Biotech综述 | CRISPR-Cas系统相关的基因编辑工具详谈）。即使存在着许多挑战，未来的一天这些工具会成为疾病治疗的新手段。

今年一月份，一百多位来自世界各地的科学家们齐聚美国加州的PalmSprings，参与了主题为基因编辑的大会。这些来自初创企业和各大高校的生物学家、遗传学家和化学家们讨论了很多话题。

这是第一届国际碱基编辑大会（International Conference on Base Editing）的现场，房间里面的气氛异常活跃。哈佛大学的HHMI研究员David Liu说，会议现场人山人海，与会者都非常兴奋。

研讨的间隙，科学家们一起在阳光下享用午餐，分享着碱基编辑领域的最新进展。3年多前的一天，David Liu课题组发布了世界上首个碱基编辑工具，标志着CRISPR基因编辑技术发展到了新的阶段【1】。

有了碱基编辑工具，科学家们可以更精确和高效地修改基因组。这种工具可以修正DNA的单碱基突变——这种看似微不足道的基因组错误导致了包括镰状细胞性贫血（sickle cell anemia）在内的数千种人类疾病。

“那是一篇突破性的论文，”明尼苏达大学的HHMI研究员Reuben Harris说，他帮助组织了一月份的会议。该论文的影响力巨大，直到今天，科学家们已经发表了300多篇关于碱基编辑的论文，把碱基编辑用于从细菌到山羊的各种生物。

现在，碱基编辑工具正在一步步向临床应用靠近。过去的几个月里，Reuben Harris，David Liu和其他实验室已经对碱基编辑工具进行了一些改进，使其更适用于临床。

科学家们已经在实验动物身上看到了成功的曙光。加州的会议结束后不久，David Liu在加拿大参加了另一场会议。在这场“基因组工程”（Engineering the Genome）会议上，David展示了课题组的最新成果：应用碱基编辑器成功治愈了患有早衰（progeria）的小鼠。这是DavidLiu实验室与美国NIH和范德堡大学长期合作的成果。“前期的实验结果让人兴奋，”David说。

6月初，David实验室的科学家通过向小鼠内耳注射碱基编辑器，部分治愈了有遗传性听力障碍的小鼠。这项工作于6月3日发表在Science Translational Medicine【2】。

然而，如果基因编辑工具要用在人身上，许多障碍依然存在，包括基因编辑的准确度，以及如何安全地将其递送到体内。David Liu承认，“人体基因编辑还处于起步阶段。”

碱基编辑器如何工作的？

要了解碱基编辑器的工作原理，我们先从CRISPR说起。这种功能强大的基因编辑技术在2012年出现，为科学家们提供了一种新的更简单的方法来对DNA进行人为的改造。在CRISPR出现之前，科学家们使用的是更笨重的工具，包括一系列改造过的蛋白，如锌指核酸酶和TALEN（Transcription Activator-like Effector Nuclease）。设计和改造这些基因编辑工具经常要耗费不少的人力物力。

有了CRISPR，科学家们不需要为了编辑特定的DNA而去设计一个全新的蛋白，只需要简单地合成一条短链RNA。这种guide RNA可以引导Cas9剪刀到达目标位置。然后，Cas9与DNA结合，在特定位点把两条DNA链剪断。David Liu说，这是一种非常有效的破坏特定基因的方法，因为在大多数细胞中，DNA被切断会导致在大量的插入或删除。

基于三种不同的蛋白，David Liu团队设计了第一种碱基编辑器——胞嘧啶碱基编辑器（cytosinebase editor，CBE）

CRISPR的应用前景吸引了David的兴趣，他和博士后Alexis Komor认为，这项技术可以做更多的事情：对DNA的四种碱基A，T，G，C进行单独的编辑。David说：“让我着迷的是，我们可以通过对基因组进行化学反应来进行更精确的编辑，而且不需要切断DNA。”

Alexis和David在2016年取得了突破。他们将Cas9与一种能够改变碱基的酶连接起来，形成重组蛋白。这种胞嘧啶碱基编辑器可以停留在基因组特定的位点，转换碱基的类型：C变成T或者G变成A。一年后，David的团队开发了腺嘌呤碱基编辑工具，可逆向改变碱基的类型（详见BioArt报道：Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC）。

明尼苏达大学的HHMI研究员Reuben Harris说，碱基编辑器融合了两种功能强大的蛋白质，创造了基因编辑的新方式。他说，把修饰碱基的酶和Cas9结合在一起，就像把花生酱和巧克力结合在一起，产生了1+1>2的效果。

DNA有四种碱基，碱基编辑器可以把任何一种转换成另一种吗？

大多数碱基编辑器只能进行某些类型的转换，但是一个全新的工具可以做更多的事情。七个月前，David Liu团队发明了prime editor，这是另一种能够精确编辑基因组的技术（详见BioArt报道：David Liu再出重磅基因编辑新工具，可实现碱基随意转换与增删）。Prime editor仍然依赖Cas9的DNA结合能力，但这一次，David和他的博士后Andrew Anzalone将其与另一种酶融合，可直接将特定序列插入基因组。

如果把Cas9比作一把剪刀，碱基编辑器就是一支铅笔，而prime editor就是一台文字处理器。David说，prime editor可以进行“搜索和替换”：锁定目标DNA片段，并用指定的新片段去替换掉原有的片段。

David的团队用prime editor在哺乳动物细胞中进行了各种可能的DNA编辑，而不仅仅是简单地插入或删除DNA片段。David透露，实验室的大部分工作都致力于提高prime editor和碱基编辑的实用性，以早日用于临床治疗。

三种功应用于哺乳动物细胞的基因编辑系统（图源：David Liu/Fairman Studios, LLC）

如何应用这些基因编辑的工具？

如果你向David Liu了解基因编辑在疾病治疗方面的潜力，他会给你一些数字来说明问题。

David说，超过75000种基因突变与人类疾病相关，其中约一半是单碱基突变。单碱基突变中，三分之二是C到T，G到A或者反方向的碱基的转换。David指出，这些变化正是碱基编辑器可以修复的。这种基因的点突变是早衰、代谢紊乱、耳聋和失明等遗传疾病的分子基础。Prime editor提供了更大的灵活性，因为它可以修复范围更广的基因缺陷。例如，囊性纤维化是由三个碱基的缺失导致的。

碱基编辑和prime editing也是两项有望用于疾病治疗的新技术。与Cas9核酸酶类似，碱基编辑器和prime editor都可以在哺乳动物细胞中工作。碱基编辑器和prime editor都还没有进入临床试验，科学家们需要时间对它们进行一些微调。David说，学术界和工业界的科学家正在动物身上测试碱基编辑器和prime editor，为以后在病人身上的应用铺平道路。

超过37000种已知的点突变与疾病相关。胞嘧啶碱基编辑理论上可以修正14%的突变（C-G到T-A），而腺嘌呤碱基编辑可以修正大约一半的突变（A-T到G-C）（图源：David Liu/Fairman Studios, LLC）

目前，碱基编辑器和prime editor都已经在实验室中得到应用，如用来修改培养的细胞的基因。与植物打交道的研究者会用这些工具来改造植物的特性，比如引入对除草剂的抗性。

中国科学院遗传与发育生物学研究所的高彩霞表示，碱基编辑器和prime editor都极其重要，尤其是对农业而言。2020年3月16日，高彩霞实验室与David Liu合作在Nature Biotechnology 发表论文，将prime editor成功应用于植物（详见BioArt报道：遗传所高彩霞研究组建立植物基因组引导编辑技术体系Plant Prime Editing）。

碱基编辑器用于疾病治疗之前还有哪些挑战？

不到4年的时间里，碱基编辑器已经从理论转化为潜在的疾病疗法。但是，这种基因疗法可能还需要很多年的深入研究才能真正进入临床。David Liu在2018年创立的Beam Therapeutics公司，最近公布了使用碱基编辑器治疗镰状细胞病和alpha-1 antitrypsin deficiency的临床前数据。

去年，来自中国科学家的研究成果对碱基编辑器“亮起了红灯”。根据发表在Science上的两篇论文，在小鼠胚胎和水稻中，胞嘧啶碱基编辑器的脱靶效应超过了科学家的预期（详见BioArt报道：Science丨杨辉/高彩霞组“背靠背”首次发现单碱基编辑存在严重脱靶效应）。

领导其中一项研究工作的高彩霞说，这些碱基编辑器有时会在其他地方改写基因组。对临床应用而言，脱靶效应可能会带来有害的突变。

“我们当时有点震惊，这样的结果是我们意料不到的，”高彩霞说，“这是一个极其重要的发现，我们必须重新考虑如何优化碱基编辑器。”David Liu马上给她发了一封email说：“这是一篇很棒的论文。”

David已经预料到碱基编辑可能出现脱靶效应的问题。David说，这两篇Science文章激励他和其他人去寻找脱靶效应的解决方案。“我认为碱基编辑领域的每个人都有责任去深入研究，以减少脱靶效应的产生。”David Liu说。

今年2月，研究人员在Nature Biotechnology上发表了一项解决方案。他们开发了一种快速检测错误编辑的方法，并创建了一套新的胞嘧啶碱基编辑器，使编辑错误降低了10到100倍（详见BioArt报道：Nat Biotech | CBE单碱基编辑器的Cas9非依赖型DNA脱靶风险的评估及优化）。“我们很想解决这个问题，”David说。这篇论文是最近科学家们在该领域发表的许多论文之一，其他研究小组也报道了新的精确度更高的碱基编辑器。David和其他人将继续改进碱基编辑技术。

David的论文发表不久后，明尼苏达大学的HHMI研究员Reuben Harris在Life Science Alliance上报道了另一种提高胞嘧啶碱基编辑器精确度的方法【3】。David Liu团队开发了三种新的Cas9蛋白，可以靶向曾经无法编辑的区域（详见BioArt报道：Nat Biotech | 第4期导读——ApCas9技术进化等）。6月，另外两个研究小组报道了双碱基编辑器，可以综合腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器的编辑能力（详见BioArt报道：专家点评4篇NBT | 双剑合璧——李大力组开发新型双碱基编辑器）。David在最近的Cell上发表了论文，用人工智能来预测碱基编辑的结果【4】。

Reuben Harris说，碱基编辑仍然不完美，但最近一系列的突破是“朝着正确方向迈出的几步”。

如何将碱基编辑器包装好以应用于临床

大多数药物都是可以包装在药丸里的小分子，而基因编辑工具是又大又复杂的分子——不能把它们塞进药片里让病人吞下，或者把它们直接注射到体内。David认为，必须找到其他方法，帮助这些分子进入病人的细胞。

其中一种方法依赖于病毒。科学家们可以将基因编辑工具包装在腺相关病毒等小型病毒内。这些病毒已经在好几种FDA批准的药物中得到应用，它们可以感染细胞，释放负载的成分。

科学家也在开发完全不同的药物递送系统。脂质纳米颗粒是一种选择，这需要电场将基因编辑工具导入细胞，然后将细胞移植到患者体内。

美国基因与细胞治疗学会主席、马萨诸塞州大学医学院的高光坪教授说，基因编辑工具的递送仍然是一个主要的障碍，但他仍对基因编辑的未来感到兴奋。“基因疗法在正处于黄金时代，为疾病治疗开辟了更多的途径。”

  In vivo base editing restores sensory transduction and transiently improves auditory function in a mouse model of recessive deafness. Sci Transl Med. 2020;12(546):eaay9101.doi:10.1126/scitranslmed.aay9101

3. McCann JL, Salamango DJ, Law EK, Brown WL, Harris RS.MagnEdit-interacting factors that recruit DNA-editing enzymes to single base targets. Life Sci Alliance. 2020;3(4):e201900606. Published 2020 Feb 24.doi:10.26508/lsa.201900606

4. Arbab M, Shen MW, Mok B, et al. Determinants of Base EditingOutcomes from Target Library Analysis and Machine Learning [published online ahead of print, 2020 Jun 9]. Cell. 2020;S0092-8674(20)30632-2.doi:10.1016/j.cell.2020.05.037