重大进展，华东师范大学叶海峰团队研发新型光控基因编辑系统学术资讯

来源：iNature

许多研究表明，CRISPR-Cas9系统是一项革命性技术。这种相对易于使用的技术为科学研究和疾病治疗提供了前所未有的机会，包括在高通量筛选和功能基因组学研究中的应用以及病毒感染，遗传疾病和癌症的治疗。尽管如此，CRISPR-Cas9系统现在存在几个众所周知的缺点，包括脱靶编辑的可能性以及随之而来的时空控制编辑需求。

2020年7月10日，华东师范大学叶海峰团队在Science Advances 在线发表题为“Engineering a far-red light–activated split-Cas9 system for remote-controlled genome editing of internal organs and tumors”的研究论文，该研究描述了一种远红外光（FRL）激活的Split-Cas9（FAST）系统，该系统可以在哺乳动物细胞和小鼠中强烈诱导基因编辑。

通过基于发光二极管的FRL照明，FAST系统可以有效地编辑人类细胞中多个基因座的基因，包括非同源末端连接和同源性定向修复。此外，该研究显示FAST可以很容易地在tdTomato报告基因小鼠中实现FRL诱导的内部器官编辑。最后，在小鼠异种移植肿瘤模型中，证明FAST可以实现PLK1癌基因的FRL触发编辑。除了扩展用于CRISPR-Cas9技术的光遗传学工具箱中的光能谱外，这项研究还展示了FAST系统如何可以在生物学和生物医学领域中用于可编程的深层组织基因编辑，以实现高精度和空间特异性。

许多研究表明，CRISPR-Cas9系统是一项革命性技术。这种相对易于使用的技术为科学研究和疾病治疗提供了前所未有的机会，包括在高通量筛选和功能基因组学研究中的应用以及病毒感染，遗传疾病和癌症的治疗。尽管如此，CRISPR-Cas9系统现在存在几个众所周知的缺点，包括单指导RNA（sgRNA）有时会导致脱靶效应，例如未靶向基因组区域中的双链断裂；不良后果，例如基因突变，插入，缺失，甚至致瘤事件。
为了克服这些挑战，已开发出几种提高CRISPR-Cas9基因编辑精度的策略，包括Cas9修饰（例如，Cas9切口酶和高保真变体），prime编辑器，碱基编辑器，以及选择具有最小异源性的sgRNA。最近，已经开发出一些可诱导的Cas9表达系统来限制Cas9的活性或寿命，从而通过减少细胞基因组对Cas9核酸酶的暴露时间来降低脱靶效应的可能性。
有多种化学诱导的CRISPR-Cas9系统，包括强力霉素调节的Cas9，甲氧苄啶（TMP）和4-羟基他莫昔芬（4-OHT）控制的Cas9，雷帕霉素诱导的Cas9 等。但是，这些系统的显著不利影响是来自化学诱导剂的细胞毒性：强力霉素可对细胞数量和集落形成产生负面影响，TMP可抑制细胞摄取叶酸，4-OHT可以增加自噬体的胞质水平并导致核内染色质不规则团聚，雷帕霉素会干扰雷帕霉素途径的内源性哺乳动物靶点。此外，一旦这些试剂进入细胞内部或存在于体内，这些化学物质便可以自由扩散，从而限制了编辑诱导的空间分辨率。另外，难以快速去除诱导剂化合物，因此它们可以持续很长时间，从而难以快速准确地打开和关闭Cas9活性。
这些限制已帮助激发了基于Cas9的光学控制的多个系统的开发，因为光是一种可逆且无创的诱导方式，可以潜在地提供精确的时空分辨率。第一个报道的可光活化Cas9系统的例子是基于蓝光的paCas9系统。在paCas9系统中，Cas9核酸酶被片段化为两个非功能性片段，可以根据各自融合域的二聚化，在蓝光下重组为活性核酸酶，它们来自丝状体的pMag或nMag。
最近还报道了一种基于蓝光的抗CRISPR系统，包括AcrIIA4（一种有效的Cas9抑制剂）和LOV2蓝光光电感应器。没有照明，AcrIIA4-LOV2复合物仍与Cas9结合，从而抑制其核酸酶活性。在蓝光下，AcrIIA4-LOV2复合体与Cas9分离，可以恢复其编辑活性。然而，由于生物组织对这些光能的强烈吸收和散射，紫外线和蓝光都无法深入地渗透到体内。紫外线几乎不能穿透皮肤，而蓝光仅能穿透1毫米。这种实质性的局限性以及紫外线和长时间的蓝光暴露会引起细胞毒性，突出表明了将这些光诱导的Cas9系统应用于体内研究应用和临床转化的难度。
一段时间以来，研究人员一直在研究远红外光（FRL）诱导的遗传系统，这是由于FRL在皮肤表面以下5毫米以上的深层组织穿透作用。研究人员在这里报告了开发的FRL激活的Split-Cas9（FAST）系统，该系统可用于无创地诱导位于动物组织内部深处的细胞中的基因编辑活性。FAST系统依赖于两个具有高亲和力结合结构域的split-Cas9融合蛋白：Cas9的一半是组成型表达的，而另一半则是在细菌性植物色素BphS光学可控系统的FRL诱导控制。
研究人员首先将FAST系统转入到人类胚胎肾脏（HEK）–293细胞中，并使用基于发光二极管（LED）的FRL照明来证明其激活了靶向基因组编辑。接下来，在多种人类细胞系中实现FRL诱导的编辑后，FAST能够强有力地激活皮下动物组织中细胞的编辑。转基因tdTomato报告基因小鼠系的实验建立了FRL诱导的FAST介导的小鼠体细胞（肝脏中的肝细胞）编辑，证明了FAST可以针对疾病。因此，除了扩展用于哺乳动物细胞基因编辑的光遗传学工具箱，使其包括通过FRL具有高度体内相容性和深层组织穿透力的诱导之外，该研究还扩展了这一技术，以证明与基础生物学和生物医学研究相关的应用。

来源：Plant_ihuman iNature

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