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来源：BioArt植物
有了冷冻电镜（cryo-EM）技术，科学家们可以在溶液中观察生物大分子的各种构象状态。蛋白质构象的变化发生于多种生物反应的过程中，如酶遇到了底物、蛋白分子机器的各种成分组装在一起、以ATP或GTP的形式为蛋白分子机器提供能量等。结合精确控制的喷雾-混合系统，冷冻电镜可以捕捉到蛋白质样品非常迅速的（毫秒级）构象变化，这种方法也叫time-resolved cryo-EM【1】。
2020年8月10日，美国哥伦比亚大学的Bridget Carragher课题组在Nature Methods 杂志发表了题为Time-resolved cryo-EM using Spotiton 的论文，报道了他们开发的Spotiton冷冻电镜样品制备系统，可捕捉非常迅速的蛋白质构象变化。
研究者报道了他们开发的喷雾-混合系统Spotiton（图1）【2，3】。在10毫秒内，两个喷头把约50uL的样品液滴分别洒在网格上。约100毫秒后，网格被浸入液体乙烷，样品的混合也随之停止。进一步地，研究人员在四种蛋白样品（核糖体亚基之间的结合、RNA聚合酶与启动子的结合、钙离子与钾离子通道的结合、动力蛋白dynamin对GTP的水解）中测试了该系统的强大功能。
图1. Spotiton系统的示意图，右图为左图绿框范围的放大
加入钙离子后，钙门控的钾离子通道（calcium-gated potassium channel）MthK会在毫秒内激活，并在两秒内逐渐失活【4，5】。正因为其活化状态的持续时间非常短，之前的单颗粒冷冻电镜研究只捕捉到MthK的两种构象：无钙离子的关闭状态和有钙离子时的失活状态，而缺少了活化状态下的MthK结构【6】。这项研究中，实验人员成功使用Spotiton机器人在约150毫秒内制备了结合钙离子的MthK样品，并且收集了冷冻电镜数据。可以明显地看到，MthK的跨膜区和配体结合区之间存在明显的倾斜，而这正是MthK活化的标志之一（图2）。
除此以外，作者还用Spotiton联合单颗粒冷冻电镜研究了30S和50S核糖体亚基组装成70S核糖体的过程、大肠杆菌RNA聚合酶结合λPR启动子的初始状态、以及动力蛋白对细胞膜进行收缩时的构象变化。
这四个案例代表了持续时间非常短的生物大分子状态。研究证明，Spotiton系统可以有效混合样品，并在约100毫秒内快速使样品玻璃化，捕获生物反应的中间状态。这种方法所需的材料非常少，可用于混合任意两个或多个样品。天下武功，唯快不破。有了Spotiton系统，科学家们可以观察到生物分子之间发生初始相互作用后50到500毫秒之间的状态。
参考文献
1. Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy: recent progress. J. Struct. Biol. 200, 303–306 (2017).
2. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B. & Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. J. Struct. Biol. 179, 68–75 (2012).3. Dandey, V. P. et al. Spotiton: new features and applications. J. Struct. Biol. 202, 161–169 (2018).4. Zadek, B. & Nimigean, C. M. Calcium-dependent gating of MthK, a prokaryotic potassium channel. J. Gen. Physiol. 127, 673–685 (2006).5. Posson, D. J., Rusinova, R., Andersen, O. S. & Nimigean, C. M. Calcium ions open a selectivity filter gate during activation of the MthK potassium channel. Nat. Commun. 6, 8342 (2015).6. Fan, C. et al. Ball-and-chain inactivation in a calcium-gated potassium channel. Nature 580, 288–293 (2020).
1. Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy: recent progress. J. Struct. Biol. 200, 303–306 (2017).
2. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B. & Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. J. Struct. Biol. 179, 68–75 (2012).3. Dandey, V. P. et al. Spotiton: new features and applications. J. Struct. Biol. 202, 161–169 (2018).4. Zadek, B. & Nimigean, C. M. Calcium-dependent gating of MthK, a prokaryotic potassium channel. J. Gen. Physiol. 127, 673–685 (2006).5. Posson, D. J., Rusinova, R., Andersen, O. S. & Nimigean, C. M. Calcium ions open a selectivity filter gate during activation of the MthK potassium channel. Nat. Commun. 6, 8342 (2015).6. Fan, C. et al. Ball-and-chain inactivation in a calcium-gated potassium channel. Nature 580, 288–293 (2020).
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41592-020-0925-6
来源：bioartplants BioArt植物
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3ODY3MDM0NA==&mid=2247497660&idx=4&sn=4cca331f0a758a8701c99b3f3946b220&chksm=fd736ddbca04e4cdebfcf3b143700cd89ac875f58906ee3d1d817201a82fdfb22940d9a3e2e5#rd
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