冷冻电镜助力破译大脑的分子密码

来源：中科院之声

大脑中有上千亿个神经细胞，又叫神经元，它们之间通过百万亿个突触联结形成复杂有序的神经网络与环路。神经网络中高度有序的神经活动则构成了认知、思维、意识和语言等高级脑功能的基础。就像通讯系统中，信息的收发和存储依赖于通讯网络的基站，神经信息的传递与存储的最基本结构与功能单元则是神经突触。

突触功能的发挥则依赖于突触中大量蛋白分子的协调工作，其中一种特殊的蛋白分子叫受体分子，也就是信息的接收器。当信息传递到突触时，突触前神经元就会释放信号分子（神经递质）到突触间隙，突触后神经元上的受体就会接受信号分子，使下一级神经元产生兴奋或抑制。这些受体蛋白在突触中的功能结构状态以及它们在突触中的数量和排列方式直接影响着大脑信息传递的效能。突触又能够根据神经活动的强弱而改变自身传递效能，亦即突触可塑性，在这一过程中，突触中的蛋白分子数量和分布会发生变化，而记忆很可能恰恰就存储于突触中受体蛋白的组织和分布变化中。

精确解析突触的蛋白分子结构和组织架构、及其在神经活动或异常过程中的变化无疑是解密大脑奥妙的一个关键环节，也是脑科学与脑疾病研究中最基础的核心研究方向之一。对大脑中各类受体蛋白为主的分子机器的作用机理进行解密，通俗讲既是破译大脑的分子密码。

“眼见为实”，借助成像手段直接透视生命体系中的物质组成与结构和内在规律，一直是生命科学研究的不二之法。神经突触的大小在几百纳米的尺度（大概是头发丝直径的百分之一）。突触中的分子就更小了，通常在几个纳米左右。在这个尺度下，只有光学显微镜和电子显微镜能够具备这种成像条件。光学显微镜由于光波长（200-600纳米）的限制，仍旧没有办法观测到突触中的纳米尺度的分子。电子显微镜所采用的电子波长经过加速后可达0.002纳米，能够观察到高分辨的分子乃至原子信息。更进一步，冷冻电镜技术使得我们可以直接观察被快速冷冻固定（零下180°左右）在近生理状态下的样品。

冷冻电镜（CryoEM）技术的快速发展，一方面使得众多通过分离纯化后的蛋白质等生物大分子近原子分辨三维结构得以解析，正因为如此2017年诺贝尔化学奖颁发给三位冷冻电镜技术的开拓者。另一方面，基于最新的冷冻电镜断层三维成像技术（CryoET）能够对保存在近生理状态下细胞和组织样本进行纳米分辨率的三维成像，为在神经突触及其它细胞区室中原位解析蛋白质分子结构和组织架构带来了新的契机。

近日，中国科学技术大学与中国科学院深圳先进技术研究院双聘教授毕国强和刘北明团队，与美国加州大学洛杉矶分校周正洪教授合作，通过发展前沿冷冻电镜细胞原位成像技术，首次解析了抑制性突触中GABAA受体的原位三维结构，并首次阐释了抑制性突触中受体蛋白和骨架蛋白层级化的组织规则。研究成果以 Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses为题发表在Nature Neuroscience上(DOI: 10.1038/s41593-020-00729-w).

在前期的工作中，研究人员将大鼠胎鼠的海马体神经细胞解离并直接培养在冷冻电镜的样品载网上（类似于光学显微镜成像使用的载玻片），经过一段时间的培养后神经细胞之间能够形成突触连接，进而形成微型的神经网络。这种样品可以直接通过投入式快速冷冻固定，既是将电镜载网直接投入到液氮冷却的液态乙烷中，这样在几十毫秒内，神经细胞被冷冻固定到-180°以下，样品内部近生理状态下的结构细节得以保存，从而实现了对细胞的瞬间“定格”。这种样品可以直接传输到冷冻电镜中进行冷冻电镜断层三维成像（将样品进行倾转，同时收集不同角度的二维投影），经过后期三维重构处理，即可重现细胞内分子水平的三维结构细节，进而实现了对细胞超微结构的“回放”。

利用这种手段并结合自主研发的新型冷冻光电关联显微成像技术，研究人员开创性地对神经突触超微结构与功能进行研究，解析了首个完整神经突触的高精度三维结构，并实现了对中枢神经系统中两类最主要突触-兴奋性与抑制性突触的精确区分以及结构特征的定量化分析(Tao, Liu et al. 2018a; Tao, Liu et al. 2018b; Liu, Tao et al. 2019; Sun, Liu et al. 2019)。 

图1. 冷冻电镜断层原位成像技术解析神经突触受体蛋白原位结构与组织分布

在此基础上，研究团队发展了一种基于过采样与自动分类的冷冻电镜断层三维成像亚区域图像处理方法，实现了对细胞断层三维重构图像中无标记和无模板依赖的蛋白质自动识别和三维重构分析。基于这一方法，研究团队实现了对抑制性突触中GABAA受体的自动化识别并解析了其19Å分辨率的原位三维结构，这是目前已报道的首个突触原位受体蛋白结构。

进一步，通过对GABAA受体在突触中的空间分布进行分析，发现这些受体在抑制性突触中呈现层级状的组织分布特性：GABAA受体之间可以形成具有距离固定（11nm间距）而相对角度可变的双分子复合物；这种双分子复合物进一步组成具有较低熵并且具备自组织特性的二维网络；最后形成具有清晰边界并介于固、液之间的“介态”相分离状态（mesophasic organization）。这些组织形式可以通过突触后支架蛋白和受体之间灵活的相互作用而形成，并且与突触前囊泡释放位点存在对应关系。

图2. 抑制性突触中受体等蛋白分子与细胞器组织分布的三维可视化

抑制性突触中受体蛋白的这种半稳定的组织架构很好地体现了神经突触既能保持信息传递稳定性又具备可塑性的结构基础，从分子组织结构层面很好地解释了学习与记忆的结构机理。通过应用与发展前沿细胞原位冷冻电镜断层成像技术这种全新的尝试，实现了对突触生理状态下分子水平结构与功能探究的突破，为破解大脑的分子密码迈出了关键的一步。

参考文献：

1. Tao, C. L., et al. (2018). "Differentiation and Characterization of Excitatory and Inhibitory Synapses by Cryo-electron Tomography and Correlative Microscopy." JNeurosci 38(6): 1493-1510.

2. Tao, C. L., et al. (2018). "Accumulation of Dense Core Vesicles in Hippocampal Synapses Following Chronic Inactivity." Front Neuroanat 12: 48.

3. Liu, Y. T., et al. (2019). "Postsynaptic protein organization revealed by electron microscopy." Curr Opin Struct Biol 54: 152-160.

4. Sun, R., et al. (2019). "An efficient protocol of cryo-correlative light and electron microscopy for the study of neuronal synapses." Biophysics Reports 5(3): 111-122.