延胡索酸通过共价修饰Gasdermin蛋白抑制焦亡学术资讯

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焦亡（Pyroptosis）是十分重要的炎症性细胞死亡类型，在感染性、自身免疫性疾病乃至肿瘤中都有重要的作用。近年来，Gasdermin家族蛋白功能的解析使其成为重要的研究热点（『珍藏版』特别推荐丨全景式展现细胞焦亡研究历程——在细胞死亡的研究中，从来不缺少有趣的故事）。Gasdermin蛋白将成为未来疾病治疗极具潜力的希望靶点。
焦亡（Pyroptosis）命名取自希腊语中“pyro-”（意为fire），用来代表细胞死亡中发生炎症进展的特征，所以其发生有如燎原之势：进展较快，伴有明显炎症。故如何寻找有效且高效的抑制焦亡的干预策略是研究人员思索的关键。Petr Broz课题组曾在Science报道细胞内ESCRT系统可修复焦亡中产生的膜孔逆转焦亡【1】（详见BioArt报道：Science丨科学家发现对抗焦亡的膜修复分子机器）。但细胞内是否存在天然抑制Gasdermin家族的功能蛋白或者小分子仍是未知。 2020年8月20日，麻省大学医学院Katherine A. Fitzgerald课题组在Science杂志上发表了题为“Succination inactivates gasdermin D and blocks pyroptosis”的研究工作，第一次发现Gasdermin家族成员中GSDMD和GSDME可被代谢中产生的延胡索酸在特定半胱氨酸位点上加上2-(succinyl)修饰，从而抑制其形成寡聚体，阻止焦亡的发生。

研究人员一开始就关注到细胞代谢可通过多种方式影响炎症反应，例如在LPS刺激的巨噬细胞中存在由氧化磷酸化为主过渡到以糖酵解为主的代谢转换，而三羧酸循环中的代谢物的产生和累积可能也在调节炎症的基因表达中扮演正向或者负向的角色。研究人员设计了很简单的实验检测代谢对细胞焦亡的影响：利用经典LPS+Nigericin处理骨髓来源的巨噬细胞BMDM，同时分别加上三羧酸循环中的各种代谢中间产物，发现延胡索酸二甲酯（dimethyyl fumarate,DMF）可特异抑制细胞焦亡和GSDMD的活化。而不能渗透入细胞的延胡索酸单甲酯（Monomethyyl fumarate,MMF）则不能抑制细胞焦亡。

三羧酸循环中，延胡索酸可在其水化酶（Fumarate hydratase）的作用下加上H2O转变为苹果酸。研究人员利用FHIN1抑制水化酶功能可累积细胞内的延胡索酸，发现对焦亡有抑制作用，并且抑制了GSDMD-N的活化。此外，研究人员也进一步证实，DMF对焦亡的抑制作用不依赖于已经报道的NRF2和GAPDH对炎症的调节作用【2,3】。

2-(succinyl)-Cysteine修饰是延胡索酸二甲酯共价到半胱氨酸的一种不可逆修饰，目前已经报道GAPDH和KEAP1可被修饰【2,3】。研究人员利用化学蛋白质组学和点击化学技术寻找DMF在焦亡中的作用靶点，通过设计MMF-Yne（MMF-Alkyne）以模拟DMF对底物的作用，并可实现质谱检测。随后GSDMD被鉴定为MMF-Yne的底物，并且这种修饰作用可以被DMF竞争性抑制。通过液相色谱-质谱联用，研究人员发现人源GSDMD的Cys191（鼠源Cys192）可以较高丰度被2-(succinyl)修饰。

GSDMD-C192位点已被证实介导GSDMD的寡聚化【4】，研究人员也发现GSDMD-C192A突变体在293T里不能引发细胞焦亡，故无法直接证实DMF通过该位点抑制GSDMD功能。但研究人员仍DMF处理可以抑制Caspase-1与GSDMD互作，但不影响Caspsae-1的自活化。
GSDMD敲除的细胞中仍存在其他焦亡的旁路，如GSDME可在缺失GSDMD后引发焦亡发生。研究人员发现DMF在GSDMD缺失的细胞中也具有焦亡抑制作用，并证实该作用通过类似的修饰作用，并找到GSDME的Cys45位点可被修饰而抑制功能。
在本研究的最后部分，研究人员集中探究了DMF在自身免疫性疾病中的作用。DMF已经被FDA批准为多发性硬化的（MS）治疗药物，但尚没有研究发现其效应与焦亡过程相关。研究人员发现MS患者中存在GSDMD和IL-1beta的活化，这提示DMF可能通过抑制焦亡实现对MS的治疗作用。研究人员继续利用两种疾病模型证实DMF对GSDMD的抑制作用。现有研究已证实，GSDMD介导的焦亡在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和家族性地中海发热（FMF）中参与病理过程【5,6】。通过EAE造模小鼠和FMF模型小鼠MefvV726/726的实验证实，DMF可以明显抑制这两种模型中由焦亡造成的免疫和炎症的发生，减缓了疾病进展。本研究入手选取简单的研究方法找到了延胡索酸对焦亡的抑制作用，并利用化学蛋白质组学找到了GSDMD的底物并鉴定到修饰位点，最后通过疾病模型证实延胡索酸和DMF对焦亡过程的抑制作用。本文在首次发现天然存在焦亡的抑制分子之外，也为DMF这一类延胡索酸类似物的药物的功能解释了新的机制。相信这一类药物将在自身免疫性疾病治疗中大放异彩。

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