畅磊福团队阐明CRISPR-Cas12i系统的工作机理

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移动遗传元件（mobile genetic elements）通过基因水平转移对宿主基因组稳定性造成破坏。CRISPR-Cas系统是细菌和古菌为了防御移动遗传元件的获得性免疫系统，对细胞维持基因组稳定性和完整性具有重要意义。CRISPR-Cas相关的基因编辑工具也以其高效、简便等优势成为生命医学领域最前沿的技术之一。Type V CRISPR-Cas12系统是一类种类丰富的防御系统，目前已经有多达11种亚型（Cas12a-k）被鉴定。当前多个Cas12亚型（Cas12a/Cpf1、Cas12b、Cas12e/CasX及Cas12j/CasΦ）都可用于哺乳动物基因组编辑，显示出Cas12系统巨大的应用潜力。大部分Cas12亚型主要切割dsDNA，而Cas12i亚型主要切割dsDNA中的非互补链，形成单链切口（nick），其在基因编辑应用中可能具有较高的特异性【1】。Cas12i系统自身就可以完成对pre-crRNA的成熟，具有多重基因编辑的潜力；相对于Cas9和Cas12a，Cas12i分子量较小，体内递送具有一定优势。总的来说，Cas12i亚型在基因编辑应用上具有很大的潜力。

2020年9月7日，来自美国普渡大学的畅磊福研究团队在Nature Structural & Molecular Biology杂志上发表了题为“Mechanisms for target recognition and cleavage by the Cas12i RNA-guided endonuclease”的研究论文【2】。课题组利用冷冻电镜技术解析了多种不同状态的Cas12i与crRNA和dsDNA底物复合物的结构。

结合结构指导的蛋白质突变和体外切割活性实验，研究团队对PAM识别、dsDNA底物与crRNA配对进行了验证，同时鉴定了Cas12i切割pre-crRNA与底物dsDNA的酶活位点。值得注意的是，该研究团队发现Cas12i识别28 bp 底物dsDNA，并通过生化实验揭示28 bp的底物dsDNA会显著提高Cas12i切割dsDNA中互补核酸链的能力，即造成底物dsDNA双链切割。目前用于基因编辑的Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas12e等系统识别20 bp的底物dsDNA，具有一定程度的脱靶效应。因此Cas12i具有发展成保真度较高的基因编辑系统的潜力。利用三维结构分类，该研究团队还发现了Cas12i识别14-15bp 底物dsDNA的中间状态，结合生化实验发现14-15 bp的底物dsDNA就可以完全激活Cas12i的切口酶（nickase）活性，但是却无法切割dsDNA中互补核酸链，提示Cas12i工作机制很可能是两步激活：14-15bp底物dsDNA与crRNA配对后激活Cas12i切割非互补链，16-28 bp底物dsDNA与crRNA配对后激活Cas12i切割互补链。

图1. Cas12i-crRNA-dsDNA复合体的2.9Å冷冻电镜结构

该研究还捕获到了底物在RuvC结构域活性中心的状态。通过比较Cas12i不同状态的结构发现：在结合底物之前，RuvC结构域中有一个被称为lid motif的区域会遮挡住Cas12i的酶活中心，结合底物之后，lid motif区域发生一个构象变化，暴露出酶活中心。更为有趣的是该特征在其他已知结构的Cas12亚型中也被观察到了，说明了Type V CRISPR-Cas12系统拥有保守的激活机制。

图2. Lid motif结合底物前后的构象变化以及Cas12系统的激活机制

普渡大学助理教授畅磊福以及博士后张恒为该论文的共同通讯作者，博士后张恒、李壮和博士生肖任坚为该论文的共同第一作者。

参考文献
1. Yan W. X. et al. Functionally diverse type V CRISPR-Cassystems. Science, 363, 88-91, doi:10.1126/science.aav7271 (2019).2. Zhang H, Li Z, Xiao R, Chang L. Mechanisms for target recognition andcleavage by the Cas12i RNA-guided endonuclease. Nature Structural &Molecular Biology, (2020)