朱永群组首次发现特异地切割线性泛素链的全新去泛素化酶

来源：BioArt

点评 | 李姗（华中农业大学

泛素化是真核生物所特有的一种蛋白翻译后修饰，参与了真核生物众多的信号通路的调节。泛素在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的依次催化下，形成不同连接形式的多聚泛素链，其中异肽键连接的泛素链，如Lys48、Lys63连接的泛素链，是由泛素的C末端甘氨酸G76通过异肽键连接到上一个泛素分子的赖氨酸残基上。

除了异肽键连接的泛素链，一个特殊的泛素连接酶复合物LUBAC能够催化并将泛素的C末端G76与上一个泛素分子的N端甲硫氨酸M1，通过肽键连接起来，形成首尾相连的线性泛素链。线性泛素链拥有独特的构象，调节很多重要的生理过程，如细胞凋亡，胚胎发育、自噬、NF-κB免疫通路等。

真核细胞内同时也存在大量的去泛素化酶，能够水解泛素链，逆转泛素化过程，在信号转导过程中发挥着关键的“调节器”作用。不同于异肽键泛素链拥有数量庞大的去泛素化酶，线性泛素链在真核细胞内只有一个名为OTULIN（Ovarian tumour deubiquitinase with linear linkage specificity）的特异切割的去泛素化酶。虽然OTULIN能够水解线性泛素链，但是其到底是否真正地在细胞内广泛发挥线性泛素链去泛素化酶活性，还是只是作为调节LUBAC复合物活性的专用分子，还存在着争议。

病原菌在与宿主长期相互斗争的过程中，进化了各种独特的蛋白质分泌系统，如三型和四型分泌系统，分泌大量的毒性效应蛋白分子，作用于宿主细胞关键信号分子，调节宿主信号通路，拮抗宿主免疫防御和促进病原菌侵染。先前有文献报道了多个效应蛋白分子具有去泛素酶活性，切割宿主的泛素链，从而干扰宿主泛素化过程。然而这些被报道的去泛素化酶效应蛋白全部都是切割异肽键连接的泛素链，底物也都偏好于Lys63连接的泛素链。由于线性泛素链参与宿主免疫防御过程，具有很强的抑制细菌侵染的能力，因而在病原菌领域里长期以来存在着一个科学疑问：是否存在特异地切割线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白分子。

为了解决这一问题，2019年5月20日，浙江大学朱永群实验室在Nature Microbiology杂志上发表题为A bacterial effector deubiquitinase specifically hydrolyses linear ubiquitin chains to inhibit host inflammatory signalling 的研究论文，发现了来源于病原菌的特异切割线性泛素链的全新去泛素化酶，并揭示其在病原菌与宿主相互作用中的重要功能及机制。

朱永群实验室首先设计了一个针对病原菌的去泛素化酶活性筛选实验体系。在前期研究中发现，虽然病原菌效应蛋白往往在与宿主细胞接触时被分泌出来，但是当病原菌被培养到后对数生长期时，大多数效应蛋白就已经表达了。由于泛素链只存在真核生物体内，因此可以将病原菌培养到后对数生长期，将其制备成裂解液，然后利用裂解液在体外切割泛素链。如果泛素链被水解成游离的单个泛素分子，表明该细菌裂解液具有去泛素化酶的活性。通过这一筛选体系，朱永群实验室对43种不同病原菌进行了广泛的筛选，成功地发现嗜肺军团菌裂解液具有切割线性泛素链的活性，表明嗜肺军团菌可能含有切割线性泛素链去泛素化酶活性的效应蛋白分子。

嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性胞内型病原菌，被人呼吸被动地进入肺部后，感染肺部巨噬细胞，分泌300多个效应蛋白到宿主细胞内。在巨噬细胞内，建立独特的膜泡结构，并在膜泡内大量增殖，最后导致巨噬细胞死亡，被释放出来的细菌再进行新一轮的感染。朱永群实验室随后从嗜肺军团菌中克隆149个功能未知的效应蛋白，利用293T细胞对这些效应蛋白进行表达。表达后的效应蛋白被亲和纯化出来，在体外进行针对线性泛素链的去泛素酶活性实验，从这些效应效应蛋白当中，成功筛选出唯一的一个名为RavD效应蛋白，能够切割线性泛素链。进一步的实验揭示了从大肠杆菌重组表达的RavD也能够在体外水解线性泛素链。不仅如此，在293T细胞内过表达RavD能够完全抑制细胞内线性泛素链的形成，抑制线性泛素链介导的信号转导。将ravD基因敲除后，嗜肺军团菌就完全丧失了切割线性泛素链的能力。

图2. RavD特异地切割线性泛素链。

随后的生化实验揭示，RavD只特异地切割线性泛素链，不能切割任何异肽键连接形式的泛素链，表明RavD是一个特异切割线性泛素链的去泛素化酶。朱永群实验室进一步解析了RavD与线性泛素链的复合物结构，发现RavD具有独特的Cys-His-Ser催化三联体基序，其三维结构不同于先前发现的所有去泛素化酶，是一个全新的去泛素化酶。RavD利用两个不同的泛素结合表面，从而区别异肽键泛素链和线性泛素链，对线性泛素链进行特异的识别。生化实验发现，突变催化氨基酸残基或者线性泛素链识别的氨基酸残基都完全破坏了RavD对线性泛素链的切割能力。研究还发现，RavD利用其C末端结构域，特异地结合磷脂酰肌醇PI(3)P 和PI(4)P，从而在巨噬细胞内定位到嗜肺军团菌的膜泡上，然后突出其N端去泛素化酶结构域，持续性地切割膜泡上形成的线性泛素链，避免膜泡上线性泛素链的累积，达到抑制宿主NF-κB免疫信号的目的。RavD广泛地存在于军团菌属细菌中，其同源蛋白也都具有切割线性泛素链的去泛素化酶活性，表明切割线性泛素链是军团菌属细菌在宿主细胞内生存的一个普遍机制。

图3. RavD作用机制模式图。a. RavD水解线性泛素链的酶学活性示意图。b. RavD在嗜肺军团菌感染过程中的作用机制模式图。RavD被四型分泌系统分泌后，在宿主巨噬细胞内定位到嗜肺军团菌膜泡结构上，清楚膜泡上的线性泛素链，抑制宿主NF-κB免疫通路。

这项研究首次发现一个特异地切割线性泛素链的全新去泛素化酶，解决了病原菌领域的一个长期科学问题，发现了病原菌抑制宿主NF-κB免疫信号通路和泛素化信号通路的一个新机制，以及揭示了军团菌属病原菌一个普适的胞内生存机制。另外，该研究所建立的筛选体系将帮助人们发现更多的病原菌去泛素化酶。由于与真核去泛素化酶完全不同，RavD可以被开发成研究线性泛素链的全新研究工具，促进真核细胞信号转导的研究。

据悉，朱永群实验室的博士生万木阳和博士后王小飞为本文的共同第一作者，朱永群教授为本文的通讯作者。参加该研究的还有朱永群教授实验室研究生的黄春峰、徐丹丹、王钊和浙江大学生命科学学院的周艳研究员。

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专家点评

李姗（华中农业大学生命科技学院、生物医学与健康学院教授）

病原细菌的分泌系统（三型，四型，六型分泌系统等）分泌效应蛋白（effector）来模拟激活或阻断宿主细胞的多种信号通路，是“病原-宿主互作”中重要的生物学过程。泛素信号通路在真核细胞中的重要作用不言而喻，因此该信号通路也成为病原细菌进攻并干扰宿主细胞正常生理活动的重要靶标。目前已经报道的参与调控泛素信号通路的病原细菌效应蛋白或蛋白家族有多于10个，其中包括以脱氨酶形式作用于泛素（CHBP／Cif）或E2（OspI）而阻断信号的效应蛋白，模拟宿主的HECT家族（SopA，NleL）、RING家族（LubX，NleG）、F-box家族（AnkB，LegU1）的具有E3 ligase活性的效应蛋白，具有全新结构域的E3 ligase（IpaH，SidC），以甲基转移酶活性作用于宿主E3 ligase的效应蛋白（NleE），以及去经典K48/K63链接泛素链的去泛素化酶（SseL，ChlaOTU）等。

病原菌对宿主的“劫持”几乎涵盖了现在关于泛素信号通路的各个层级，朱永群研究组提出大胆假设，是否病原菌进化出可以去线性化泛素链的去泛素化酶，类似真核生物中的OUT蛋白。于是作者针对这个假设，设计了一个easy experiment，体外合成线性化泛素链，将病原菌的细菌裂解液加入，看是否能有变化。用此“简单”assay（操作简单，但是idea新颖），筛选了43种病原菌，发现有且只有肺炎军团杆菌细菌裂解液具有去线性泛素链的活性；进一步筛选军团杆菌143个四型分泌系统效应蛋白，发现有且只有RavD蛋白有此活性。之后生化细节、结构机理及感染时生物学意义的研究顺理成章。RavD因其对线性泛素链特异的活性，将来或许可被开发成为研究线性泛素链信号转导的有效工具。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41564-019-0454-1