张宁/白凡/曾木圣合作揭示混合型肝癌分子特征和诊断标志物

来源：BioArt

原标题：Cell Stem Cell聚焦争议 | 老年或疾病状态下，人类大脑海马仍然存在神经再生

原发性肝癌（简称肝癌）每年造成全球约70万病人死亡且过半死亡病例来自中国，其致死率在所有癌种中高居第二。肝癌主要分为三种类型，肝细胞癌(~80%)、肝内胆管癌(~15%)和混合型肝癌(~5%)【1】。混合型肝癌兼具肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分，是预后最差的一种肝癌。目前，混合型肝癌的分子特征未知，缺乏准确诊断标志物，因此其精确诊断和靶向治疗一直是原发性肝癌领域的重大难题。

2016年，北京大学第一医院张宁实验室和北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）白凡实验室联合Gastroenterology发表题为VariableExtent of Intra-tumor Heterogeneity Revealed by Genomic Sequencing of MultipleLesions in Patients with Hepatocellular Carcinoma的研究论文，该研究首次揭示一例混合型肝癌患者的肝细胞癌和胆管细胞癌成分来自共同起源且存在表型转化这一现象。但是该结论的普遍意义仍待进一步认证。

2019年5月23日，Cancer Cell以长文形式在线发表了张宁团队、白凡团队、中山大学肿瘤防治中心曾木圣团队和日本理化研究所(RIKEN)中川英刀团队联合主导的国际合作研究成果。在题为Genomic and Transcriptomic Profiling of Combined Hepatocellularand Intrahepatic Cholangiocarcinoma Reveals Distinct Molecular Subtypes的论文中，研究人员综合利用多种测序方法、数据分析和实验手段，系统研究了混合型肝癌三种病理亚型的基因组特征，提出了混合型肝癌分子分型标准，揭示了混合型肝癌中肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分的克隆起源关系，发现了新的诊断和预后标志物，这些结果为混合型肝癌的临床诊断、预后和治疗提供了关键信息。

此项研究中，研究人员从天津肿瘤医院、中山大学肿瘤防治中心、日本广岛医学中心和新加坡总医院等8家医院收集了133例混合型肝癌病例的临床样本和病例信息进行研究。为了深入探究混合型肝癌中两种病理成分的克隆起源关系，本研究根据两种成分的物理分布，将混合型肝癌分为三个亚型：Separate type (分开型)、Combined type (结合型) 和 Mixed type (混匀型)，并且针对三种亚型分别设计了针对性研究方案。

首先，经过外显子测序、全基因组测序和转录组测序，研究人员系统分析了混合型肝癌的高频驱动事件，包括体细胞突变、HBV插入位点、拷贝数变异，融合基因，结构变异，差异表达基因等，全面绘制了混合型肝癌的基因组图谱。随后通过同TCGA，ICGC等国际和国内组织发表的肝细胞癌和胆管细胞癌数据综合比较，研究人员发现，混合型肝癌中显著富集TP53突变，同时缺乏肝细胞癌中富集的CTNNB1突变，缺乏胆管细胞癌中富集的KRAS突变，该结果初步揭示了混合型肝癌独特的基因组特征。

其次，通过分子分型探究，研究人员发现Combined type (结合型)混合型肝癌同胆管细胞癌分子图谱相近，而Mixed type (混匀型)混合型肝癌同肝细胞癌分子图谱相近，而且研究人员发现这两种亚型的免疫微环境也存在较大差异，暗示其对免疫治疗的应答会有所不同。这些结果提示这两种病理类型混合型肝癌应该采取不同的治疗方案。

第三，通过激光显微切割，突变肿瘤细胞占比分析和单细胞测序等技术，研究人员分析和比较了混合型肝癌中的肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分，发现这两种成分既有单克隆起源也有多克隆起源。同时，通过重构亚克隆组分析，研究人员还推断了Separate type (分开型)的肿瘤转移路径，揭示了其表型转化和演化规律。

最后，研究人员发现Nestin蛋白表达可以作为混合型肝癌的诊断和预后标志物。免疫组化分析结果显示，Nestin 蛋白在混合型肝癌中的表达水平和阳性率均显著高于肝细胞癌和胆管细胞癌。通过分析预后数据，Nestin 阳性表达病例在混合型肝癌中呈现显著较差的预后，而且这一发现同样适用于肝细胞癌和肝内胆管癌。这些结果说明，Nestin蛋白可以作为混合型肝癌乃至肝细胞癌和肝内胆管癌的预后标志物。

据悉，北京大学第一医院助理研究员薛瑞栋、天津肿瘤医院肝胆外科主治医师陈璐，北京大学生物医学前沿创新中心博士生张冲和日本理化研究所的藤田征志是该论文的并列第一作者。北京大学张泽民教授、新加坡国立大学Steve George Rozen教授、新加坡癌症研究中心BinTean Teh教授和美国NIH癌症研究中心的王心伟教授对本研究提供了重要指导。

参考文献：

1、Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R. L., Torre, L. A., & Jemal, A. (2018). Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians, 68(6), 394-424.

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.04.007

专家点评

惠利健（中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所、上海科技大学；中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院，研究员，从事肝脏疾病的分子病理机制的研究。）；孙露露（中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，博士研究生）；章正涛（中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，博士研究生）

肝癌主要以肝细胞肝癌（占80%）和肝内胆管癌（占15%）为主。近年来，这两种类型肝癌的分子图谱已经描绘成功，为肝癌机制研究和诊断治疗提供了宝贵的资源。混合型肝细胞-胆管癌（cHCC-ICC）作为一种少见的肝癌类型，肿瘤预后差；并且由于缺乏cHCC-ICC发生的分子特征，长久以来，cHCC-ICC的病理分类一直饱受争议并且缺乏准确的诊断及精确的治疗。之前2017的Journal of Hepatology 报道6例外显子数据，2018的Nature Communications报道7例外显子数据，但这两项小规模的工作获得cHCC-ICC的分型不全，数据非常有限。

张宁、白凡、曾木圣、Hidewaki Nakagawa等团队合作在最新一期Cancer Cell上发表的工作，整合了全基因组测序、外显子组测序、转录组测序、单细胞核测序等技术精细描绘了133个亚洲病人来源的cHCC-ICC分子特征图谱，全面覆盖了“Separate”, “Combined”和“Mixed”三种病理类型，首次基于大样本测序描述了cHCC-ICC的分子“蓝图”。通过与肝细胞肝癌，胆管癌在基因组和转录组水平的比较，揭示了混合型肝细胞-胆管癌具有独特的分子特点，包括更高的TP53突变，更低的CTNNB1和KRAS突变等。转录组分型则表明“Combined”和“Mixed”类型的混合型肝细胞-胆管癌是两种不同的亚型，“Combined”类型表现较强的ICC样特征，“Mixed”类表现类HCC样特征。这些分子特点为混合型肝细胞-胆管癌患者的诊断和治疗提供了一定的导向性。作者还发现Nestin在cHCC-ICC中显著高表达，并且Nestin高表达的患者生存率更低，因此Nestin可以作为混合型肝癌的一个新的诊断和预后标志物。

更为有意思的是，作者探索了不同亚型cHCC-ICC的起源和表型转化，通过进化树分析发现“Separate”类型的cHCC-ICC存在单/多克隆的起源，而“Combined”和“Mixed”类型均起源于单克隆。值得一提的是，通过突变的肿瘤细胞占比分析，作者推论HCC细胞可在不同突变及微环境下继续形成HCC细胞或直接转变为ICC细胞。之前，利用小鼠谱系追踪研究，给出了肝细胞向ICC细胞转化的证据。但是人类肝细胞与小鼠肝细胞区别巨大，迫切需要新的手段来证明肝细胞向ICC转变的证据，比如可以结合人类原代肝细胞或者功能肝细胞的类器官培养技术，对ICC的肝细胞起源进行研究。

此项工作和前期的肝癌规模化测序，为肝脏肿瘤的诊断和治疗提供了大量参考性的靶点。至此，肝脏相关的主要肿瘤的测序工作基本完备，相关的遗传学突变信息极大丰富。未来，需要更多的研究工作集中于探究这些遗传学变化在肝癌发生发展中的作用，包括与肿瘤微环境细胞协同，从而对于肝脏肿瘤的防治提供关键信息。比如，利用人类肝细胞和其他肝脏微环境细胞，顺序诱导前期测序工作所鉴定的高频致癌因子，将提供一个模拟肝脏肿瘤早期发生的过程，对肿瘤的早期机制鉴定和预防提供指导。