杨朝勇/王炜团队发展肠道“暗物质”在体微生物行为研究新方法学术资讯

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人类生活与微生物密切相关，在自然界存在的细菌中，与人类关系最为密切的当属定植在消化道中的微生物群。近十几年来科学界对肠道菌群的研究呈爆发式增长，但整个领域的研究过于依赖于各类DNA测序手段，对于肠道细菌在体内的生长、代谢等微生物学过程知之甚少。只有对这些细菌的基础行为有了深入理解，才能真正深究菌群在宿主生理和病理过程中发挥的各类复杂功能。然而，由于目前许多肠道细菌在实验室中仍无法单独培养，导致人们对这部分菌群的了解还相当匮乏，因此称其为肠道中的“暗物质”。而那些能够在实验室中进行培养的肠道细菌，其在体外的研究结论能否完全反映其在体内的真实生物学行为，目前也仍存在一定争议。因此，在肠道菌群研究领域中非常需要能够直接在体探究肠道微生物活动的方法，以便了解其在体内原位的生长、代谢和繁殖情况。 9月4日，上海交通大学医学院分子医学研究院杨朝勇，王炜团队在Science Advances在线发表了题为Revealing the in vivo growth and divisionpatterns of mouse gut bacteria 的研究论文，利用D-型氨基酸在体序贯标记技术，结合使用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）探针，研究小鼠肠道中的各类细菌在体内的生长分裂方式，为揭开这些肠道“暗物质”的神秘面纱提供了首个可行的研究方法。

细菌细胞壁上的肽聚糖（peptidoglycan）在合成和代谢过程中，会通过青霉素结合蛋白（penicillin binding protein, PBP）的转肽酶结构域在其五肽结构末端的D-型氨基酸（D-amino acid, DAA）处发生替换（与周围环境中的其他DAA）、水解（去掉最末端的D-丙氨酸）等修饰，并且细菌的某些PBP对DAA的侧链上的基团有很高的容忍性。因而，如果在细菌生长环境中加入带有荧光基团的fluorescent DAA（FDAA）探针，在其细胞壁的代谢过程中探针就可以被共价地连接到肽聚糖的寡肽结构中。由于绝大部分种类的细菌都存在较为保守的肽聚糖结构，因而在灌胃使用后，FDAA探针可以通过小鼠肠道细菌本身的生长代谢过程，实现对大多数肠道菌群的荧光标记。在此项工作中，研究人员序贯使用带有不同颜色的FDAA探针（TADA, Cy5ADA）灌胃，对小鼠的肠道菌群进行在体标记，以此使得绝大部分肠道细菌会同时带有两种荧光的标记信号。由于新合成的细胞壁区域会带有较强的第二探针信号，因此两种荧光在细胞壁上的分布可以反映细菌在标记过程中的生长分裂情况。随后，将盲肠的菌群样品分别使用靶向染色特定种属细菌的FISH探针，即可通过荧光成像明确各种细菌相应的生长分裂模式（图1），这其中也包括了尚无法在体外进行单独培养和研究的肠道细菌。

图1 FDAA序贯标记结合FISH染色示意图及肠道菌群双色荧光标记成像
研究者分别观察了小鼠肠道内6种革兰氏阳性和6种革兰氏阴性菌属（genus）在体原位的生长分裂模式。并在此基础上，设计靶向特定细菌物种（species）的FISH探针，在种水平上观察不同细菌在体内的生长分裂情况，其中明确了6种不可培养细菌的分裂模式。此外，该团队还成像观察到分节丝状菌（Segmentedfilamentous bacteria, SFB）这一重要的免疫相关的肠道细菌在体内的生长分裂情况，利用双色荧光成像提供的微生物学信息，可以分析SFB细菌成熟分化过程的不同阶段，为研究SFB在体内的微生物活动提供了新的策略。

图2 FDAA序贯标记的SFB双色荧光成像图
此外，近期该团队还开发了可对肠道细菌在体的生长代谢活性进行直接定量的新方法。研究人员首先证明了FDAA的标记强度能够准确地反映细菌的生长代谢水平。通过灌胃FDAA在体标记各类肠道细菌后，结合FISH探针靶向菌群中感兴趣的特定种属，进而可利用流式细胞术分析该类细菌的FDAA荧光强度，从而对其在体的生长代谢水平进行直接定量。该团队将这一定量方法用于肠道菌群代谢活性的昼夜节律研究，发现小鼠肠道中革兰氏阳性菌在夜间生长代谢活跃，而革兰氏阴性菌则恰好相反，为理解菌群在体内的微生物活动规律提供了新的见解。该工作于2020年5月发表在德国应用化学 (Angew.Chem. Int. Ed. 59: 11923) 。

综合上述两个工作，该研究团队基于FDAA代谢标记与FISH染色，开发了可定性研究各类肠道细菌在体原位生长分裂方式的新策略，并可利用这一原理对肠道细菌在体原位的生长代谢水平进行直接定量，成功建立了一套独立于DNA测序之外的肠道细菌在体研究的新颖方法，为揭开肠道“暗物质”的秘密提供了新工具。
值得一提的是，近年来该研究团队利用其开发的FDAA在体代谢标记这一策略发展了多种肠道菌群研究的新策略。在19年发表的一项工作中（Nat. Commun. 10: 1317），该团队与北京大学陈兴教授团队合作，应用FDAA序贯标记，提出了首个可用于研究粪菌移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）后植入菌存活情况的非测序方法。研究者利用FDAA探针代谢标记供体小鼠的肠道菌群，在移植给受体小鼠后，利用带有第二种颜色的FDAA探针灌胃标记受体小鼠总体的肠道菌群，以此能够通过细菌上两种荧光信号的标记分布情况来判断植入菌在受体内的存活情况（存活下来的植入菌应当同时带有两种颜色的FDAA标记）。此外，该研究团队与交大医学院谭蔚泓教授团队合作，基于FDAA代谢标记策略，结合使用近红外二区（NIR-II）染料，首次实现了肠道菌群的实时活体成像（Angew. Chem. Int. Ed. 59：2628），为可视化观察体内深层组织中的各类细菌提供了一个便捷的研究工具。

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