【催化】新颖筛选方法和突变方式提升苏氨酸醛缩酶的催化活性和立体选择性

来源：X一MOL资讯

β-羟基-α-氨基酸是一类重要的手性砌块，通过对官能团的进一步修饰，能够合成多种手性药物。苏氨酸醛缩酶催化醛和甘氨酸羟醛加成反应，可以一步合成β-羟基-α-氨基酸，具有环境友好，反应条件温和等优点。酶促催化羟醛加成反应引入C-C键形成两个手性中心，最明显的应用瓶颈是β-位的立体选择性不高，导致生成的是异构体混合物。为了解决该酶催化反应的立体选择性控制问题，中国科学院天津工业生物技术研究所的朱敦明和吴洽庆研究团队开发了一种新颖的苏氨酸醛缩酶催化活性和β-碳立体选择性筛选方法。基于与底物官能团（氨基、羟基）相互作用的组合突变方式，利用开发的筛选方法，获得了β-碳的立体选择性提高或者翻转的有益突变体。

产物β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心，在D-或L-苏氨酸醛缩酶催化下生成非对映异构体，采用HPLC等方式分析产物的立体选择性难以适用于大规模的筛选。天津工业生物技术研究所团队设计并建立了偶联立体选择性的脱水酶，针对苏氨酸醛缩酶的合成活性和立体选择性的可视化筛选方法（图1）。偶联脱水反应特异性地分解羟醛加成中的一种构型产物生成相应的酮酸，分别以醛和酮酸作为检测化合物，建立了Purpald和Fe3+比色法。消耗的醛和生成的酮酸分别衡量L-threo/erythro-β-羟基-α-氨基酸和L-threo-β-羟基-α-氨基酸，进而测定突变体的催化活性和立体选择性。筛选方法应用于整细胞转化，结果表明可视化方法与HPLC检测结果基本一致。

图1 偶联立体选择性脱水酶的筛选方法原理

基于建立的筛选方法，对酶分子进行定向进化。首先选择活性中心的10个位点（图2A绿红色部分），又扩充了18个位点（图2A中红色部分）进行点饱和突变，都没有获得有益突变体。对活性中心的10个位点按照CASTing方式组合突变，依旧没有获得有益突变体。我们推测底物的识别和产物的特异性受到活性中心微环境影响，基于同时绑定底物官能团中羧基、羟基、氨基或苯基的考虑，同时突变不同的两个位点来绑定官能团中的两个（图2B）。突变的位点在空间上是相近的，可提高氨基酸残基的协同效应，重塑酶活性中心。

图2 点饱和突变和CASTing位点的选择(A)；基于与底物官能团相互作用的位点的选择(B)

组合突变库的筛选获得了有益突变体，在较高转化率的情况下，D93H/E147D对邻位卤代苯甲醛的de值达到70%左右，目前报道的所有底物中de值最高的。更有意义的是，D93N/E147D催化产物的构型产生了反转，即生成的产物更加偏好erythro构型，这是目前首次报道分子改造实现苏氨酸醛缩酶催化产物构型的反转。通过分子模拟阐释了立体选择性变化的机理。

这一成果近期发表在ACS Catalysis 上，文章第一作者是中国科学院天津工业生物技术研究所博士研究生陈启佳。该研究得到了国家自然科学基金(No.21602246)，中科院STS项目(KFJ-SW-STS-164)和天津市科学技术委员会(15PTGCCX00060和15PTCYSY00020)的支持。

Improving and Inverting Cβ-Stereoselectivity of Threonine Aldolase via Substrate-Binding-Guided Mutagenesis and a Stepwise Visual Screening

Qijia Chen, Xi Chen, Jinhui Feng, Qiaqing Wu, Dunming Zhu, Yanhe Ma

ACS Catal., 2019, 9, 4462-4469, DOI: 10.1021/acscatal.9b00859

导师介绍

朱敦明

https://www.x-mol.com/university/faculty/49672

吴洽庆

http://sourcedb.tib.cas.cn/cn/expert/200908/t20090817_2405589.html

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：手性β-羟基-α-氨基酸是一类重要的药用中间体，利用苏氨酸醛缩酶催化转化手性β-羟基-α-氨基酸具有非常重要的应用价值。我们研究的最初目的是获得高活性、高立体选择性的苏氨酸醛缩酶，前期克隆表达了20种不同来源的苏氨酸醛缩酶，立体选择性分析发现这些酶在β-碳的立体选择性都较差。基于对目前研究现状的认识，我们开始探索如何通过酶分子改造来获得合成活性和立体选择性显著提高的苏氨酸醛缩酶突变体。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：酶定向进化的瓶颈在于筛选，已报道的筛选方法是检测裂解方向产物或基于宿主菌生长的筛选系统，两种方式都无法检测合成方向产物的立体选择性。开发针对苏氨酸醛缩酶合成活性和β-碳立体选择性的筛选方法是亟待解决的难题，如何设计合理的筛选方法是一个很大的挑战。

在突变过程中，我们发现通常采用的位点选取方式没有起到作用，进而我们设计了与底物官能团（氨基、羟基）相互作用的组合突变方式，才获得了有益突变体。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：该研究在理论和应用方面均具有较大的意义。在理论方面，苏氨酸醛缩酶的β-碳立体选择性差，本研究对苏氨酸醛缩酶的β-碳立体选择性控制机理做了有益的探索，建立了筛选β-碳立体选择性的简便方法，为进一步研究该类酶的立体选择性控制机理奠定了基础。

在应用方面，该研究在苏氨酸醛缩酶改造方面，给研究者提供了一个高效的高通量筛选方法，为针对不同底物的酶的定向进化提供了技术支持。所涉及的β-羟基-α-氨基酸是多种药物的中间体，如氟苯尼考和屈昔多巴。在温和条件下一步合成β-羟基-α-氨基酸，对制药行业具有巨大的吸引力。我们相信随着苏氨酸醛缩酶改造研究的不断深入，将实现对苏氨酸醛缩酶催化过程中β-碳立体选择性的控制，进而达到不对称酶促合成光学纯产物，促进制药行业的节能减排、转型升级，为企业创造价值。