北大王初/陈兴合作利用半胱氨酸糖基化揭示衣康酸对糖酵解的调控作用

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原标题：Nat Chem Biol | 北大王初/陈兴合作利用半胱氨酸糖基化揭示衣康酸对糖酵解的调控作用

衣康酸（itaconate）是近年来在巨噬细胞中发现的一类具有显著抗炎活性的代谢小分子【1】。在脂多糖 (LPS) 刺激下，巨噬细胞中会发生代谢重编程，糖酵解水平会显著升高，而TCA循环会受到损害。同时，衣康酸生物合成酶IRG1蛋白的表达量会迅速上调，在巨噬细胞中催化产生毫摩级别浓度的衣康酸【2】。进一步研究表明衣康酸具有非常显著地抗炎活性，而这个内源代谢物产生抗炎作用的分子机制成为了研究热点【3】。由于衣康酸具有一个α,β不饱和羧酸的结构，理论上它可以通过迈克尔加成反应共价修饰到蛋白质的半胱氨酸残基上。最近的研究表明，衣康酸可以共价修饰KEAP1蛋白和谷胱甘肽的半胱氨酸，从而实现其抗炎活性【4,5】。

衣康酸是否具有其它蛋白底物和半胱氨酸修饰位点？这些修饰是否与衣康酸的抗炎作用有关？这些都是亟待探索的科学问题。

2019年7月22日，北京大学王初课题组和陈兴课题组合作在Nature Chemical Biology杂志上以长文形式发表了题为S-glycosylation-based cysteine profiling reveals regulation of glycolysis by itaconate的研究论文。作者利用半胱氨酸上的糖基化反应，开发了新一代半胱氨酸探针，并结合竞争性ABPP技术，首次大规模鉴定了衣康酸在巨噬细胞蛋白质组中的半胱氨酸修饰位点，进而揭示了衣康酸对糖酵解的调控作用。

基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling，ABPP）技术利用化学探针实现对蛋白质组中活性位点和特定氨基酸残基的靶向标记和检测【6】。近年来，基于半胱氨酸探针的竞争性ABPP技术被广泛应用于鉴定活性小分子的半胱氨酸修饰位点，包括代谢产物，天然产物以及共价药物等。其中最为常用的半胱氨酸探针是碘乙酰胺炔基探针，然而它只能标记蛋白质组中的一部分半胱氨酸位点。同时，由于其较高的反应活性，衣康酸这类具有低半胱氨酸反应活性的小分子很难竞争该探针的标记。因此，发展具有不同底物选择性和反应活性的新一代半胱氨酸探针是非常必要的。

陈兴课题组和王初课题组之前合作发现，用于非天然糖代谢标记的全乙酰化叠氮糖，在细胞中具有一定的非特异性副反应，即以无酶催化形式标记蛋白质组中大量的半胱氨酸位点【7】。在开发新型非天然糖来克服这一副反应的同时，作者意识到这一副反应正好可以被用来研究半胱氨酸修饰。基于此，作者进一步优化乙酰化叠氮糖与半胱氨酸的反应能力，开发了半胱氨酸标记探针1-OH-Az，其比全乙酰化叠氮糖具有更高的半胱氨酸组覆盖度，同时可以标记许多碘乙酰胺炔基探针没有覆盖的半胱氨酸位点。更为重要地是，衣康酸可以非常显著地竞争1-OH-Az对半胱氨酸的标记，表明1-OH-Az更适合于鉴定衣康酸的修饰位点。利用基于1-OH-Az的竞争性ABPP技术，作者成功鉴定到了巨噬细胞蛋白质组中260个衣康酸修饰的半胱氨酸位点。

作者发现糖酵解中的三个关键酶ALODA，GAPDH和LDHA都可以被衣康酸修饰，在这其中ALODA处在糖酵解通路的最上游。在LPS刺激的巨噬细胞中，作者验证了ALDOA的Cys73和Cys339上确实存在着内源的衣康酸修饰。更为重要地是，衣康酸可以显著地抑制ALDOA的催化活性，并且该抑制作用是依赖于衣康酸对ALDOA半胱氨酸的修饰。通过生化实验和代谢流分析，作者进一步发现衣康酸可以通过对于ALDOA的共价修饰和活性抑制从而显著地抑制巨噬细胞的糖酵解通路，而这一过程独立于此前发现的KEAP1-NRF2通路可以介导衣康酸的抗炎活性。

总之，该工作利用前沿的化学生物学技术，探索了内源活性代谢分子衣康酸在细胞内的修饰靶标，揭示了其通过负反馈调控糖酵解通路达到抗炎活性的分子机制。

本文的通讯作者为王初研究员和陈兴教授，第一作者是他们共同指导的北大-清华生命科学联合中心2014级博士研究生秦为。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41589-019-0323-5

参考文献

1. O’Neill, L. A. J. & Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nat. Rev. Immunol. 19,273–281 (2019).

2. Michelucci, A. et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 7820–7825 (2013).

3. Lampropoulou, V. et al. Itaconate links inhibition of succinate dehydrogenase with macrophage metabolic remodeling and regulation of inflammation. Cell Metab. 24, 158–166 (2016).

4. Mills, E. L. et al. Itaconate is an anti-inflammatory metabolite that activates Nrf2 via alkylation of KEAP1. Nature 556, 113–117 (2018).

5. Bambouskova, M. et al. Electrophilic properties of itaconate and derivatives regulate the IκBζ-ATF3 inflammatory axis. Nature 556, 501–504 (2018).

6. Niphakis, M. J. & Cravatt, B. F. Enzyme inhibitor discovery by activity-based protein profiling. Ann. Rev. Biochem. 83, 341–377 (2014).

7. Qin, W. et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic glycan labeling. Angew. Chem. Int. Edn 57, 1817–1820 (2018).