aBIOTECH：李剑峰团队综述高效dCas-TRD和dCas-TAD系统学术资讯

来源：植物科学最前沿

全方位的植物靶向基因调控对于植物学基础研究中的基因功能研究，作物分子育种以及合成生物学均具有重大意义。CRISPR/Cas基因编辑技术自问世以来，由于其操作的简易性，已成为植物研究中普遍使用的基因敲除工具。但是，近年来在动物细胞中的研究表明，CRISPR/Cas技术在基因敲除过程中产生的DNA双链断裂可能引起染色体的意外缺失或重排。因此，不依赖DNA双链断裂的基因失活工具同样值得关注与推广。另一方面，基于cDNA超表达的基因激活面临转基因沉默以及多基因超表达时工作量倍增等缺点，使得植物基因激活工具同样具有巨大的需求和广阔的运用空间。

Deactivated Cas (dCas)是指通过点突变失去核酸酶活性的Cas蛋白。dCas蛋白(如dCas9) 可与转录抑制结构域（TRD）或转录激活结构域(TAD)融合，再通过sgRNA靶向目标基因的启动子，从而抑制或激活目标基因的转录。该策略充分利用了CRISPR/Cas技术的简易性以及多元化（multiplex）的靶向能力，从而可以从染色体内源基因座对多个基因进行同时抑制或激活。

近日，中山大学李剑峰教授团队在aBIOTECH期刊在线发表综述文章：

The working dead：repurposing inactive CRISPR-associated nucleases as programmable transcriptional regulators in plants

该综述介绍了在动植物和细菌中建立的高效dCas-TRD和dCas-TAD系统。在dCas-TRD方面，在细菌中仅使用dCas9蛋白即可有效抑制靶基因的转录。该方法又称CRISPR interference（CRISPRi），可很好地解决细菌因缺乏RNA interference（RNAi）而无法进行基因沉默操作的问题。在人和动物细胞中，通常使用KRAB转录抑制结构域来增强dCas9介导的转录抑制。在植物中，dCas9-3×SRDX被证明具有较强的转录抑制活性，其中SRDX是植物内源转录抑制子中常见的TRD。

在dCas-TAD方面，目前在人和动物细胞中常用的高效基因激活系统包括SunTag、VPR、scRNA以及SAM。在植物中，SunTag策略同样被证明具有较强的转录激活活性。此外，植物中建立的高效转录激活工具还有CRISPR-Act2.0和dCas9-TV系统。上述动植物中的高效转录激活系统拥有一个共通之处，即在仅使用单一sgRNA的前提下，可通过dCas9或sgRNA募集多个或多种TAD，从而通过叠加或协同效应强化基因激活。此外，在动植物细胞中，可通过TRD或TAD搭配其它dCas蛋白（如dCas12a）获得目标启动子中更多可选择的靶位点。

该综述还总结了植物研究中利用多种dCas-TRD和dCas-TAD进行转录调控时发现的一些普遍规律，并探讨了今后这些靶向转录调控工具的优化思路以及应用前景。

来源：frontiersin 植物科学最前沿

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