Neuron：曹锐峰团队揭示细胞整合应激反应调控生物昼夜节律的机制

来源：BioArt

生物昼夜节律性在控制生理特性和行为方面发挥重要作用，我们都知道，在哺乳动物中，动物24小时的节律性主要受下丘脑的视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）调控，而视交叉上核的节律由来自视网膜的光信号调控。在分子水平，生物钟蛋白BMAL1和CLOCK形成二聚体而调控生物钟基因Period1-3和Cryptochrome1，2的转录，形成一个负反馈环。

目前，除了在基因转录水平的调控，生物节律在蛋白质翻译水平的调控逐渐受到重视。例如明尼苏达大学医学院曹锐峰团队之前的研究发现，在SCN中，mTOR信号通路通过磷酸化4EBP1进而控制Vip蛋白质翻译来控制动物的节律性的强弱【1】，MAPK通路通过调节eIF4E磷酸化，进而控制生物钟基因Per1和Per2的蛋白质合成来调控SCN对光的反应【2】。eIF2是另外一个重要的蛋白质翻译因子，由三个亚基α, β, γ组成。eIF2的活性通过eIF2α的磷酸化来控制。该信号通路在细胞整合应激反应（Integrated stress response，ISR）过程中起关键作用。目前研究发现，ISR参与影响多种神经退行性病变，例如阿尔兹海默症和帕金森疾病。在这些疾病中，病人的昼夜节律通常会紊乱，甚至这些节律的变化早于神经系统症状而发生，但其机制尚不清楚。eIF2通路及其激酶GCN2在生物钟中的生理作用尚不清楚。

2019年9月12日，明尼苏达大学医学院曹锐峰团队与加拿大麦吉尔大学Nahum Sonenberg和Shimon Amir团队（共同一作为Salil  SauravPathak和柳栋博士）合作在Neuron杂志上发表文The eIF2α Kinase GCN2 Modulates Period and Rhythmicity of the CircadianClock by Translational Control of Atf4，揭示了蛋白质翻译因子eIF2的激酶GCN2在整合应激反应与生物节律调控中的功能。

首先，研究人员通过利用GCN2基因敲除小鼠（GCN2-/-），观察它们的行为的节律性是否受到影响。研究人员发现，与正常对照组相比，GCN2敲除小鼠行为的节律性大为减弱，这一点通过记录并比较它们的周期图（periodogram）峰值就可以得出结论，同时，如果将它们调整为不同的光照周期（jet-lag），GCN2敲除小鼠也能更快的适应到新周期中。在黑暗中，这些小鼠的生物钟周期也有所延长。进一步观察SCN中PER1和PER2的表达后发现，它们的表达同样受到了影响，表现为在GCN2敲除小鼠中表达水平及其日间震荡的幅度降低，这可能是行为节律性减弱的一个直接原因。这些结果说明GCN2对维持小鼠的昼夜节律性至关重要。 

下一步，为了进一步证实eIF2信号通路在调控生物节律的作用机制，研究人员采用了一种eIF2α基因突变小鼠eIF2αA/A;ftg。在这种小鼠中，eIF2α基因磷酸化位点的51位丝氨酸突变为Serine 51突变为丙氨酸，从而无法磷酸化。为了小鼠能够存活，同时转入了带有Lox-P标记的野生型eIF2α基因，这样就能控制特定组织的eIF2α的表达。与野生型小鼠相比，这些小鼠的eIF2α和PER蛋白在SCN内高表达，生物周期变短。通过注射表达Cre重组酶的腺相关病毒到SCN内阻断了该区域野生型eIF2α的表达，结果降低了SCN内的eIF2α和PER蛋白的表达，小鼠的生物周期也恢复到了正常水平。这些结果表明eIF2α的活性直接调控PER蛋白的水平和动物生物节律的周期。

同时，为了在细胞水平进行验证，研究人员体外培养了PER2::LUC小鼠来源的成纤维细胞，这种小鼠体内PER2带有荧光素酶标记，因此能够通过记录生物荧光信号来记录生物钟基因的表达水平。通过应用一系列作用于eIF2通路的抑制剂和激活剂，得出了和动物模型类似的结论：增强eIF2α的磷酸化水平可以使细胞的生物钟周期变短，相反，抑制eIF2α磷酸化水平可以使细胞生物钟周期增长。另外, 研究人员发现ATF4是eIF2信号通路控制生物钟的靶基因，为了在动物中验证这个结论，研究了ATF4+/-小鼠的节律性行为，结果发现，与野生型相比，这些小鼠生物节律性有所减弱，周期也有所增长，这类似于在GCN2-/-小鼠中的表现，说明ATF4可能作为GCN-eIF2通路的的下游靶点，调控生物节律性。 

最后，为了进一步明确ATF4调控生物钟的分子机制，研究人员通过ChiP-Seq筛选了ATF4在一系列生物钟基因中的结合位点，发现ATF4能够在多个生物钟基因特别是Per2的增强子区域结合。通过ChIP方法验证了ATF4在Per2中的结合位点并发现ATF直接激活Per2的转录。ATF4蛋白质翻译受到eIF2通路的密切调控，因此，eIF2信号通路可能通过控制ATF4蛋白质翻译进而调控生物昼夜节律。

总体来讲，这项研究发现ISR与生物昼夜节律调控之间的相互关系，可以通过GCN2-eIF2-ATF4通路实现。这一机制有可能是一个适用于细胞和生物个体的在进化中保守的机制，确保细胞的应激状态直接影响细胞对时间的感知。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.08.007

参考文献

1. Cao, R., Robinson, B., Xu, H., Gkogkas, C.,Khoutorsky, A., Alain, T., ... & Sonenberg, N. (2013). Translationalcontrol of entrainment and synchrony of the suprachiasmatic circadian clock bymTOR/4E-BP1 signaling. Neuron, 79(4),712-724.

2. Cao, R., Gkogkas, C. G., De Zavalia, N., Blum, I.D., Yanagiya, A., Tsukumo, Y., ... & Amir, S. (2015). Light-regulatedtranslational control of circadian behavior by eIF4E phosphorylation. Nature neuroscience, 18(6), 855.