Nature：张昱博士揭示染色质环挤出过程在V(D)J重组中的重要作用

来源：BioArt

B细胞产生的多样化抗体是免疫系统抵抗感染的重要屏障。抗体分子由配对的免疫球蛋白重链（IgH）和轻链 (IgL) 组成。IgH和IgL分别具有可变区和恒定区，可变区结合特异的抗原，而恒定区将信号传递给下游的效应器分子，产生特异的免疫反应。可变区的多样性极大，是抗体能够识别环境中各种抗原的基础。

V(D)J 重组是编辑可变区的编码基因的重要步骤，在抗原受体基因位点通过对数量众多的V（variable ），D（diversity），J（joining） 基因片段进行配对，切割和重接，产生机体初始的多样化抗体谱。V(D)J重组自1978年发现以来，有很多重要的研究工作为其机制阐述做出了突出贡献，包括发现RAG (recombination-activating gene) 蛋白介导V(D)J重组过程中的DNA识别和切割，发现非同源末端连接（nonhomologous end-joining）DNA修复途径介导切割后DNA的连接，以及发现RAG靶位点”易接近性”(accessibility) 对于有效重组的重要性【1】。然而，由于抗原受体基因本身极为复杂，可横跨数百万个碱基对，包含数量众多的调控元件，因此，V(D)J重组机制中一个重要的中心问题仍然有待解答：在复杂的染色体上，RAG蛋白结合一个靶位点后，怎样有效的找到另一个靶位点进行配对和切割？

2019年9月11日，来自哈佛大学医学院/波士顿儿童医院的Frederick W. Alt团队在Nature上发表文章The fundamental role of chromatin loop extrusion in physiological V(D)J recombination(本文第一作者为张昱博士，现为Western Michigan University Homer Stryker M.D.School of Medicine的助理教授， Xuefei Zhang博士为共同一作)。该文发现RAG蛋白通过线性扫描 (linearscanning) 染色质有效地介导生理上的删除性D-to-JH 重组，并揭示了粘连蛋白（cohesin）介导的染色质环挤出 (chromatin loop extrusion) 过程在B淋巴细胞生理性V(D)J重组中的重要作用。

RSS（recombination signal sequence）是RAG酶的识别序列，RAG的有效切割发生在一对匹配的RSSs之间。IgH基因的D片段和J片段有序的分布于IgH 3’端的染色质结构域中，其中，在IgH V(D)J 重组中起重要作用的 IgH 增强子，4个JH片段，以及与J片段临近的D片段DQ52一同构成重组中心。D片段上游和下游各有一个RSS, 因此理论上, 下游D-RSS介导的删除性D-to-JH重组和上游D-RSS介导的翻转性D-to-JH重组都能有效发生。有意思的是，生理性的D-to-JH重组几乎全部是由下游D-RSS介导的删除性重组。长期以来，研究人员将这个现象归结于下游D-RSS的序列更接近于RSS的保守序列，因而更能有效介导重组。由于文献中支持这个观点的核心实验是在染色体外的质粒上进行【2】，无法模拟染色体上的复杂调控，因此作者在小鼠v-Abl progenitor B 细胞的内源性IgH上重新研究了这个问题。 

张昱博士等通过一系列详尽的对于IgHD-RSS的精确突变实验，发现令人意外的是，导致删除性D-to-JH重组产物占绝大优势的决定因素并不是上游D-RSS和下游D-RSS的序列区别，而是两个D-RSS的方向差异。下游的D-RSS与JH-RSS相向（convergent）排列，在RAG结合V(D)J重组中心（recombination center）的JH-RSS后向D基因片段所在区域扫描染色质的过程中能够被有效识别，因此能有效介导删除性重组。而上游的D-RSS与JH-RSS同向（same orientation）排列, RAG线性扫描过程中“看不见”这个方向的D-RSS，因此不能有效介导翻转性重组。举例来说，DFL16.1是距重组中心约52-kb的一个D基因片段，生理情况下，下游D-RSS介导D-to-JH 重组的能力约为上游D-RSS的1000倍。而当作者将DFL16.1下游RSS翻转，使之与JH-RSS同向后，这个原本非常活跃的D-RSS几乎完全丧失D-to-JH重组能力；反之，将DFL16.1上游RSS翻转，使之与JH-RSS相向排列后，这个原本不活跃的D-RSS活性大为增加，其介导D-to-JH重组的能力能与活跃的下游RSS媲美。 

作者进一步研究发现DFL16.1上得出的D-RSS与JH-RSS相对方向决定其D-to-JH重组效率的规律能够扩展到其它几乎所有的DH，充分说明RAG线性扫描染色质对于有效介导生理性D-to-JH 重组的重要性。结合之前Alt实验室发现RAG线性扫描染色质也是介导RAG脱靶切割的重要机制【3】以及提出的新的抗体重排激活酶RAG介导V(D)J重排的模型【4】（Cell丨巴钊庆博士等揭示CTCF结合元件在V(D)J抗体重排中的重要作用）, 说明有别于传统认知的RAG依靠染色质自由扩散寻找靶位点（可以配对不同方向的靶位点），线性扫描染色质（只可见一个方向的靶位点）才是RAG在染色质环结构域内寻找靶位点的固有机制。 

唯一一个例外的DH，是位于V(D)J重组中心，与JH仅相隔700-bp的DQ52，其下游RSS在翻转成与JH-RSS同向后，依然能有效介导重组（翻转性重组） . 作者通过针对于DQ52的一系列的突变研究发现，DQ52的特殊性与其所在的重组中心位置直接相关，将DQ52移至约52-kb以外的位置则该特性消失，说明RAG靶位点在物理距离非常靠近时，除了线性扫描染色质以外，还能够通过自由扩散有效配对。

作者进一步研究了RAG染色质扫描的机制。作者巧妙的通过设置“路障”干扰RAG扫描的方式探究其相关的分子机制，发现促进染色质结构域形成的环挤出过程【5】是在V(D)J重组过程中发挥重要作用。作者利用RAG扫描路径中的高度重复DNA序列，设计了一个在短距离内多次结合DNA的 CRISPR/sgRNA, 引导没有DNA切割功能，但保存了DNA结合功能的核酸酶失活版Cas9 (nuclease-dead Cas9, dCas9)结合该重复DNA位点。dCas9的串联结合形成了一个强有力的路障，显著的减少了dCas9结合位点下游的RAG切割，而dCas9结合位点处则成为了一个新的RAG切割热点。出乎意料的是，虽然dCas9结合位点并没有熟知的介导染色质环形成的CTCF结合元件，但染色质构像捕获实验却探测到了V(D)J重组中心与dCas9结合位点处显著的相互作用峰，与此同时，重组中心与dCas9下游的染色质互作显著减少。ChIP-seq进一步发现介导环挤出的粘连蛋白在dCas9结合的DNA位点上有显著积聚。这些发现，揭示了人为引入的“路障”可以通过阻碍染色质环挤出过程而有效的阻碍RAG扫描过程。而“路障”本身则由于形成了新的与重组中心的互作环，可以靶向介导RAG的切割。 

作者还发现，B细胞发育中的内源性机制也可以同样通过干涉环挤出来影响RAG的靶向切割。作者证明了活跃的转录区也可以通过与重组中心的染色质互作而成为环挤压介导的RAG扫描的“路障”。文中通过删除转录的启动子将转录过程废止后，原来转录区与重组中心的染色质互作，粘连蛋白的积聚以及RAG的靶向切割完全消失，而其下游靶位点的RAG切割则相应的增强。

图：染色质环挤出介导删除性D-to-JH重组的模型。该模型的详细视频介绍网址为：https://youtu.be/bzXAKX6j-hg

综上，该项工作为V(D)J重组过程中RAG酶的靶向切割机制提供了重要参考。作者通过对IgH DH-RSS 的详尽的突变实验首次证明了RAG线性扫描染色质在介导生理性D-to-JH重组过程中具有决定性作用，并进一步通过设置“路障”干涉RAG扫描过程以及染色质互作分析，揭示了染色质环挤出形成染色质结构域的动态过程是促进RAG扫描及定位切割靶位点的重要机制。这也为RAG在某些B和T细胞肿瘤中的异常切割提供了新的机制解释。文章发现除了CTCF外，多种其他因子，包括dCas9靶向结合及活跃转录过程都能够有效的减缓染色质环挤出过程，介导新的功能性染色质环的形成，从而有效介导功能性DNA元件的配对，这为揭示动态基因组三维折叠在基因调控中的作用提供了新的思路。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/10.1038/s41586-019-1547-y  

参考文献

1. Alt, F. W., Zhang, Y., Meng, F.-L., Guo, C. &Schwer, B. Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in theimmune system. Cell 152, 417–429 (2013).

2. Gauss, G. H. & Lieber, M. R. The basis for themechanistic bias for deletional over inversional V(D)J recombination. Genes Dev. 6, 1553–1561 (1992).

3. Hu, J. et al. Chromosomal loop domains direct therecombination of antigen receptor genes. Cell 163, 947–959(2015).

4. Jain, S, Ba, Z., Zhang, Y., Dai, H.Q., Alt, F.W. (2018). CTCF-binding elements mediate accessibility of RAG substrates during chromatin scanning. Cell, https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.04.035.

5. Rowley, M. J. & Corces, V. G. Organizationalprinciples of 3D genome architecture. Nat. Rev. Genet. 19,789–800 (2018).