Nature Genetics文章：中国南方地区鼻咽癌EB病毒高危亚型

来源：Deep Omics

文章题目：

Genome sequencing analysis identifies Epstein-Barr virus subtypes associated with high risk of nasopharyngeal carcinoma

发表时间：2019年6月

期刊名称：Nature Genetics

PMID号：31209392

关键词: EBV; 病毒捕获测序; 鼻咽癌(NPC); 高危亚型;

本论文围绕中国南方地区的与鼻咽癌相关的EBV基因组展开讨论。研究团队发现了两个位于EBV基因BALF2的非同义突变与鼻咽癌风险显著相关。这两个突变位点的单体型（C-T与C-C）合并贡献了中国南方地区鼻咽癌整体风险的83%。系统发生树分析证实这些高危型EBV种系起源于亚洲，并在中国南方地区发生了克隆，感染群体扩增。

Nat Genet. 2019 Jul;51(7):1131-1136. doi: 10.1038/s41588-019-0436-5.

【病毒捕获测序检测突变】

该研究对270个样本开展了针对EBV基因组的捕获测序。其中215个样本（病例或对照）取自EBV相关癌症（鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤；有单病例多采样情况），54例健康个体（唾液样本，中国的NPC流行和非流行地区均有涉及），以及一个NPC细胞系（C666-1）。基于捕获测序数据，研究人员分析得到了一套EBV基因组突变：总共检测到8,469个突变，各样本突变数目分布在[1,006-2,104]。通过突变数据比较，研究人员发现同一个体的癌灶和唾液含有相同的EBV基因组（突变重叠比率达到99.27%）。

【BALF2基因与鼻咽癌高风险强关联】

研究人员针对EBV基因组突变进行了两轮关联分析。第一轮包含了来自于上述270个样本中的156个鼻咽癌癌灶和47个对照。首先将它们与公开的97种EBV基因组进行了主成分分析(图1a,d)，PC1呈现出连续的分布（非洲-欧洲-亚洲），亚洲明显地与非洲和欧洲分开；PC2在亚洲中呈现出可明显区分NPC流行与非流行区域的分布。

图1，即文章的Figure 1. 第一轮关联分析中的主成分分析(a)和系统发生树(b)。

中国南方地区的EBV是1类亚型(图1b)，这里采用的参考基因组为NC_007605.1。随后的全EBV基因组关联分析考虑了人群结构的潜在影响，发现了多个与NPC关联的EBV基因组突变。最强关联的突变位于BALF2基因区域(图2a,c)。多位点关联分析进一步支持BALF2基因区域的变异与NPC的强关联性(图2b-c)。

图2，即文章的Figure 2. 第一轮全EBV基因组关联分析得到的与NPC显著相关的突变位点。(a) EBV全基因组关联分析曼哈顿图；(b) 多位点关联分析后验概率；(c) EBV基因组基因分布。

【发现BALF2基因上的强关联位点】

通过贝叶斯fine-mapping分析得到BALF2基因上仅有三个非同义突变各自与NPC有显著的关联：162215C>A, 162476T>C 和 163364C>T。这三个位点的强关联在第二轮关联分析（483例NPC患者和605个健康对照）中得到了很好的验证。将两轮样本合并进行分析进一步支持了这三个位点（表1）。三个位点都有显著的连锁不平衡。通过条件分析（限定一个位点的突变），确定了前两个位点（162215C>A和162476T>C）的NPC关联性是相关的，而第三个位点（163364C>T）表现出独立的关联性。

表1. BALF2基因的三个非同义突变分别与NPC的关联。

研究人员分析了这三个突变位点形成的单体型（参考单体型为A-T-C，即低风险碱基型）与NPC的关联（表2）。他们发现，仅有突变162215_C（即C-T-C）是与NPC风险没有关联的，当然拥有该单体型的样本数目受限（仅13个）。但如果加上另两个位置的高风险碱基型（两个或其一，即C-C-T和C-C-C）就可以达到较强的NPC风险（表2的OR值）。由此推测出，NPC风险主要与162476_C和163364_T关联。进一步分析确定了这两个位点可以独立提供NPC风险（162476_C的OR值为3.31，163364_T的OR值为3.35），这也符合同时拥有二者突变的单体型C-C-T的高OR值。

表2.  BALF2基因的三个非同义突变形成的单体型与NPC的关联。

文章讨论的强关联的位点均为与BALF2基因，它是绑定单链DNA的蛋白，是病毒基因组复制模块中重要的组成部分。进而，研究人员分析了突变位点单体型与唾液中EBV丰度的关系，这里涉及到533例NPC和651例健康对照。唾液中EBV丰度波动很大，NPC患者的唾液EBV丰度显著比对照的少。比起低风险单体型A-T-C，高风险单体型C-C-T和C-C-C对应的唾液EBV丰度低（但仅为略微显著）。

【高风险EBV单体型的进化发展】

在中国南方地区的EBV流行地区，两个高风险单体型C-C-T和C-C-C非常高频，无论是NPC患者（93.27%）还是健康对照（63.04%）。而非流行地区是比较低频的：NPC患者（55%），健康对照（14.29%）。再比较亚洲之外的EBV种系，会发现几乎没有，这意味着亚洲是这些高风险单体型的起源地。

研究人员就将所有EBV捕获测序样本中是单种系感染的EBV基因组（230例）与公开的EBV基因组（97个）在一起做了系统发生树（图1b）。与之前报道的一致，所有2类的EBV基因组都分布在非洲地区。而1类的EBV基因组沿着非洲-欧洲-亚洲呈现出连续的分支进化，这和PCA的PC1的分布相符（图1b-d）。在亚洲地区，来自非流行地区的EBV基因组位于系统发生树更为基底的位置，这与PC2相符(图1b-d)。来自EBV流行地区的NPC患者的EBV基因组在系统发生树上的距离是非常近的，呈现出从一个共同祖先快速克隆复制的模式。值得注意的是，来自于流行地区的健康对照（37个）有超过一半（22个）的感染了NPC患者携带的EBV种系。

在系统发生树上，所有携带162476_C和163364_T的EBV种系都分布在亚洲的分支上，它们的携带者富集了来自NPC患者的EBV种系。然而，162215_C则具有更广泛的分布（图1b,e）。这种分布表明了，比起另外两个SNP，162215_C不太可能是NPC风险的关联位点，前面分析得到的关联性可能是由于它与162476_C的连锁不平衡。基于此，文章最后确定了162476_C和163364_T为中国南方地区NPC风险的主要关联位点：高风险单体型C-T占了45%的患者，是NPC的主要风险因子，贡献了71%的中国南方地区NPC整体风险；排第二的高风险单体型C-C贡献了10%；将二者一起考虑则贡献了83%的的整体风险。即便是在EBV非流行区域，两个单体型也贡献了50%的NPC整体风险，可见它们的高风险性如此之强。作者指出，这两个高风险关联位点的发现，一能用于临床检测，提早发现NPC，二能助力病毒疫苗设计，靶向NPC高风险的EBV种系。

【我们的思考】

以往的鼻咽癌关联分析视角是从患者自身基因组找因素，这是我们常见的传统的全基因组关联分析。论文中也提及了这些既往研究，如易感位点HLA，CDKN2A/B，TNFRSF19，MECOM，TERT等，但这些因素在NPC整体风险的贡献程度有限。本次研究转换视角，既然NPC和EBV感染是相关的，那就从EBV基因组层面去看，是不是由于病毒自身因素导致了NPC高风险，找到强关联就可以。NPC在中国南方地区呈现富集流行情况，用局部地域内的特别种系病毒感染来解释是有可能成功的。这其实也启发我们在其他与病毒相关的癌症中用这个思路，比如HBV（肝癌），HPV（宫颈癌）。另外，还可以考虑微生物相关的癌症，比如幽门螺旋杆菌（胃癌）。推而广之，局部地区内的广泛分布的因素，如饮食习惯，生活环境，也可以纳入考察因素。我之前也将类似的思路向合作方建议（宫颈癌和肝癌），当时说：或许是特别的病毒种系选择了患者。

文章最后确定的两个非同义突变162476_C和163364_T，位于BALF2基因上。这两个突变引起的氨基酸改变是如何影响BALF2基因编码的蛋白功能？这需要从蛋白功能域和蛋白质三维结构上去解读。后续是否会有团队很快跟进这方面的分析呢？明确了这些，也有助于做出针对的疫苗来。

论文提供了270个EBV捕获测序数据，可以考虑从更多方面去开展研究。如在癌基因组上的整合（尽管通常EBV整合很少发现），和EBV基因组的重组。